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文檔簡介
1、人的大腦是人體最重要的器官之一,由數(shù)目巨大的神經(jīng)元組成。神經(jīng)元之間通過彼此相互接觸完成信息的傳遞,從而實現(xiàn)接受刺激、傳導(dǎo)興奮的功能。神經(jīng)元之間的信息傳遞是通過突觸來完成的。突觸是實現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)功能的基本結(jié)構(gòu)單位。據(jù)統(tǒng)計,人體大腦中大約有1015個突觸。突觸由突觸前膜、突觸間隙和突觸后膜組成。其中,突觸間隙大約有20納米,上面有各種功能各異的蛋白和碳水化合物分子,具有非常復(fù)雜的結(jié)構(gòu)。突觸間隙最重要的功能就是通過突觸間隙上的蛋白質(zhì)之間的相互作
2、用,將突觸前膜和突觸后膜―粘連‖起來,完成神經(jīng)元之間的信息傳遞。這種蛋白我們稱之為:細胞黏附蛋白。細胞黏附蛋白由三部分組成:與細胞骨架蛋白相連接的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域,跨膜結(jié)構(gòu)域和與其它細胞黏附蛋白相互作用的胞外結(jié)構(gòu)域。大多數(shù)細胞黏附蛋白位于突觸中央,也有一些位于突觸前膜和突觸后膜反應(yīng)區(qū)的邊緣上。細胞黏附蛋白具有識別突觸前膜和突觸后膜的作用位點,傳導(dǎo)神經(jīng)信號,協(xié)助釋放突觸囊泡的功能。同時,細胞黏附蛋白分子對于突觸的形成,成熟,分化,以及維持神經(jīng)遞
3、質(zhì)受體和離子通道的正常數(shù)量也起著至關(guān)重要的作用。突觸細胞黏附蛋白的異常表達會導(dǎo)致各種神經(jīng)系統(tǒng)疾病。目前,人類在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病率日益上升,已經(jīng)成為威脅人類身體健康的最可怕的殺手之一。找到更多的細胞黏附蛋白并加強對其功能的研究,對于治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病有著重要的意義。雖然發(fā)現(xiàn)了一些細胞黏附蛋白,但是與數(shù)目眾多、種類各異的突觸相比,我們知道的僅僅是冰山一角。有研究表明:細胞黏附蛋白在非神經(jīng)元細胞上表達可誘發(fā)神經(jīng)突觸的聚集。缺失一種細胞黏附蛋白
4、可能不會導(dǎo)致突觸無法形成,但是卻可以影響突觸的結(jié)構(gòu)和功能,甚至?xí)?dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)疾病?;谏鲜鼋Y(jié)論,我們將神經(jīng)細胞和非神經(jīng)細胞共培養(yǎng)篩選出能誘發(fā)突觸聚集的基因;通過基因的過表達或敲除實驗對其功能進行研究從而發(fā)現(xiàn)細胞黏附蛋白。利用該方法可以發(fā)現(xiàn)更多的細胞黏附蛋白。
我們對麻省理工大學(xué)Broad研究所和哈佛等著名高等院校研究所研發(fā)的最新的CCSB-Broad慢病毒表達文庫進行了篩選。該文庫是在該組織早先開發(fā)的ORFeome8.1文庫的
5、基礎(chǔ)上,通過Gateway克隆的LR反應(yīng)技術(shù)將目的基因轉(zhuǎn)移到pLX304-Blast-V5載體上得到的。Gateway克隆技術(shù)是目前最先進的克隆技術(shù)之一,具有高效,快速,靈活的優(yōu)點。由于CCSB-Broad慢病毒表達文庫中缺少222個大小在3Kb以上的基因,因此在正式篩選前我們也采用Gateway克隆技術(shù)中的LR反應(yīng)將缺少的目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到pCDNA3.2v5-DEST載體上。LR反應(yīng)是在Xis、IHF和 Int等重組因子組成的 LR重組
6、酶混合物(LR Clonase enzyme mix)的作用下將入門載體(Entry Clone)上的目的質(zhì)粒 ORF(open reading frame)與目的載體 pCDNA3.2v5-DEST上的致死基因 ccdB基因互換,得到pCDNA3.2v5-DEST載體上含有目的質(zhì)粒的克隆產(chǎn)物的過程。酶切反應(yīng)采用的是限制性內(nèi)切酶BglⅡ.只用一種限制性內(nèi)切酶鑒定可以節(jié)約時間和成本。經(jīng)過酶切驗證,得到所有克隆正確的質(zhì)粒。由于不能確定所有的
7、 LR克隆產(chǎn)物全都表達膜蛋白,在蛋白印跡實驗中,驗證的樣品采用全蛋白。實驗發(fā)現(xiàn):對3.5厘米培養(yǎng)皿培養(yǎng)的HEK293T細胞來說,轉(zhuǎn)染質(zhì)粒在4微克可以達到最佳的轉(zhuǎn)染效率。目前有110個LR克隆基因可以表達蛋白。
通過LR克隆反應(yīng),我們得到幾乎所有的人類基因,共有16394種,可以對人類全基因進行全面的篩選。
本實驗形成一套穩(wěn)定的篩選方法。將1.5微克目的質(zhì)粒和0.5微克GFP-FUGW質(zhì)粒通過聚乙烯亞胺(PEI)轉(zhuǎn)染到
8、人源胚胎腎變種細胞(HEK293T)中培養(yǎng)24小時后加入培養(yǎng)九天的海馬神經(jīng)元中共同培養(yǎng)。36小時后免疫熒光染色再用高內(nèi)涵細胞成像分析系統(tǒng)進行處理,如果目的質(zhì)粒表達的蛋白為細胞黏附蛋白,就會誘導(dǎo)突觸在 HEK293T細胞周圍聚集。實驗中發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染0.25微克陽性質(zhì)粒就可以引起明顯的突觸聚集現(xiàn)象。因此,本實驗創(chuàng)新的將6中不同的質(zhì)粒等濃度混合,再轉(zhuǎn)染1.5微克混合質(zhì)粒到HEK293T細胞中進行篩選。在達到篩選目的同時也節(jié)省了大量的時間和經(jīng)費。
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