雞毒霉形體黏附蛋白及與其相互作用蛋白的初步研究.pdf

1、雞毒霉形體(Mycoplasma gallisepticum,MG)是雞慢性呼吸道病(Chronicrespiratory disease,CRD)的病原菌。本病在雞群中感染普遍,血清學(xué)陽性率高,給養(yǎng)禽業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。許多研究發(fā)現(xiàn),MG表面的黏附蛋白(ProteinMycoplasma Gallisepticum Adheain,pMGA)通過宿主上的受體侵染宿主,為了闡明pMGA與宿主受體之間的關(guān)系及其在MG侵染宿主中的作用,本

2、研究進(jìn)行了如下試驗:一、對H-pMGA1.2基因原核表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化,獲得了pKG-pMGA1.2可溶性表達(dá)的最佳條件；通過親和層析的方法,純化出純度達(dá)96％并有較高免疫學(xué)活性的目的蛋白。二、以純化的pMGA1.2為“靶蛋白”,通過免疫熒光組織化學(xué)法來驗證“靶蛋白”與SPF雞胚的心、肝、脾、肺、腎、法氏囊、氣管等組織的結(jié)合情況；提取以上各組織的膜蛋白,用Dot-ELJSA驗證各組織膜蛋白與“靶蛋白”的結(jié)合情況；組織膜蛋白進(jìn)行SDS-P

3、AGE分析。主要的試驗結(jié)果如下:
　　 1.pKG-pMGA1.2可溶性表達(dá)的最佳條件是誘導(dǎo)溫度22℃,誘導(dǎo)時間8h,培養(yǎng)基pH值7.0,IPTG濃度0.05mmol/L。在該條件下,目的蛋白在裂解液全菌體和上清液中均大量表達(dá),分別達(dá)到18.5％和17％。
　　 2.取20日齡SPF雞胚的氣管、心、肺、肝、腎、十二指腸上、法氏囊、腺胃、胸腺和脾臟等組織制成石蠟切片,再選用不同濃度的pMGA1.2與其作用,然后用兔源的MG

4、陽性血清和FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG來檢測結(jié)合的情況。結(jié)果表明:除脾臟外,其他組織中均存在與pMGA1.2特異性結(jié)合的蛋白。
　　 3.提取各組織膜蛋白經(jīng)處理后點到硝酸纖維素膜上,選用純化的pMGA1.2與其作用,再用兔源的MG陽性血清與HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG來進(jìn)一步檢測結(jié)合情況。Dot-ELISA檢測發(fā)現(xiàn)除脾臟外其他九種組織的膜蛋白中均含有與pMGA1.2相互作用的蛋白。
　　 4.通過SDS-PAGE對各組織膜蛋白