淋巴囊腫病毒受體蛋白在牙鲆組織中的分布及其黏附蛋白研究.pdf

1、魚類淋巴囊腫病(Lymphocystis disease,LCD)是一種由淋巴囊腫病毒(lymphocystis disease vires,LCDV)引起的魚類病毒病,其典型癥狀為引起魚體皮膚和淺表組織的瘤狀病變,有時在鰓、肝、脾等組織也發(fā)現(xiàn)有瘤狀物。該病呈世界性分布,流行廣泛,已知可感染42科140種以上的海水、半咸水和淡水的野生、養(yǎng)殖及觀賞魚類。該病的爆發(fā)致使魚體喪失其觀賞和商業(yè)價值,嚴(yán)重時可造成死亡,給魚類養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損

2、失。了解魚類組織細(xì)胞上與LCDV感染相關(guān)的受體蛋白,以及病毒上與細(xì)胞受體相互作用的黏附蛋白對闡明LCDV感染的機(jī)制以及該病的防控具有重要意義。
　　論文應(yīng)用本實(shí)驗(yàn)室制備的抗牙鲆LCDV27.8 kDa.受體蛋白的單克隆抗體(2G11和3D9)確定了LCDV受體在牙鲆組織中的分布,初步探討LCDV感染牙鲆過程中病毒吸附的生物學(xué)基礎(chǔ);并對淋巴囊腫病毒的黏附蛋白進(jìn)行了初步鑒定,以期為進(jìn)一步了解病毒與宿主相互作用的機(jī)制提供理論依據(jù)。另外對

3、LCDV27.8kDa受體在大菱鲆中的存在進(jìn)行了初步的檢測,為研究LCDV對魚類的廣泛性感染提供理論依據(jù)。具體研究結(jié)果如下:
　　利用LCDV受體單克隆抗體的間接免疫熒光與免疫組織化學(xué)技術(shù),對牙鲆外周血、白細(xì)胞、鰓、胃、腸、表皮、肝臟、頭腎、體腎、脾、性腺、腦、心臟等組織進(jìn)行了LCDV受體定位觀察,發(fā)現(xiàn)在牙鲆外周血白細(xì)胞、鰓、表皮、胃、腸、肝臟、脾及頭腎中均有較強(qiáng)的陽性信號,表明有LCDV27.8 kDa受體的分布,這些部位存在介

4、導(dǎo)LCDV吸附、感染牙鲆組織及在組織間擴(kuò)散的分子基礎(chǔ),推測LCDV通過與鰓、表皮及消化道上皮的受體結(jié)合進(jìn)入牙鲆體內(nèi),通過與外周血白細(xì)胞上的受體結(jié)合侵染白細(xì)胞而進(jìn)入血液循環(huán),實(shí)現(xiàn)病毒在體內(nèi)的傳播,進(jìn)而感染肝臟、脾臟、頭腎等器官。
　　利用LCDV受體單克隆抗體對大菱鲆的鰓、肝、體腎、腸、胃等組織進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)在大菱鲆的鰓、肝、胃、腸中均有蛋白條帶特異性顯色,證明在大菱鲆中同樣分布有LCDV27.8kDa受體的存在,牙鲆與大菱

5、鲆具有相同的細(xì)胞受體,且受體在體內(nèi)組織器官中的分布具有很大的一致性。通過逆向病毒鋪覆蛋白印跡技術(shù)(VOPBA)對LCDV的黏附蛋白進(jìn)行鑒定。逆向VOPBA即將LCDV提純,進(jìn)行SDS-PAGE,隨后將病毒蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,利用病毒的細(xì)胞受體蛋白與薄膜共同孵育,通過化學(xué)方法顯色,顯示出能與受體蛋白特異性結(jié)合的病毒蛋白條帶。實(shí)驗(yàn)最終得到一條能與牙鲆LCDV27.8kDa受體蛋白特異性結(jié)合的32kDa,蛋白條帶,對該蛋白進(jìn)行切膠回收后進(jìn)