維甲酸相關孤核受體α在α-黑素細胞刺激素及其類似物STY39調(diào)控樹突狀細胞成熟中的作用.pdf

1、維甲酸相關孤核受體α(retinoid acid receptor related orphan receptor,RORα,NR1F1)是一種屬于類固醇激素受體超家族成員的轉錄調(diào)控因子,它能夠直接進入細胞核調(diào)節(jié)靶基因的轉錄,從而參與多種重要生理過程的調(diào)節(jié),在形態(tài)發(fā)育、細胞增殖分化、機體穩(wěn)態(tài)維持、生物代謝調(diào)控、高級神經(jīng)功能控制以及免疫調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)RORα基因缺陷的模型小鼠體內(nèi)出現(xiàn)了廣泛而嚴重的功能性障礙,尤其是容易罹

2、患自身免疫性疾病和過敏性疾病,并表現(xiàn)出明顯的免疫功能異常,如T細胞和B細胞功能缺陷、巨噬細胞釋放致炎因子(如IL-1、IL-6、TNF-α)增多等?？梢酝茢郣ORα與免疫系統(tǒng)的關系非常密切,其抗炎作用在多種疾病實驗模型的研究中已得到證實。
　　 α-黑素細胞刺激素(alpha-melanocyte-stimulating hormone,α-MSH)是一種內(nèi)源性小分子神經(jīng)內(nèi)分泌免疫調(diào)節(jié)肽,它不僅能促進黑色素形成使皮膚變黑,而且具

3、有明確的抗炎及免疫調(diào)節(jié)作用。α-MSH通過黑皮質(zhì)素受體(melanocortin receptor,MCR)的介導發(fā)揮多種生理功能,這些受體廣泛表達于各種組織,包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)、外周組織及免疫細胞。目前已知的MCR共有5種亞型(MC1R～MC5R),除MC2R以外,其他受體均能結合α-MSH,其中MC1R和MC5R主要介導其抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用。理論上,α-MSH作為天然的抗炎免疫調(diào)節(jié)劑可以用于自身免疫病、過敏性疾病的防治以及避免移植排斥

4、反應,但由于其結合受體的選擇性低,生物學作用不僅限于免疫調(diào)節(jié),還能同時影響機體其他神經(jīng)內(nèi)分泌功能,導致皮膚變黑等,限制了α-MSH的實際應用。因此基于天然α-MSH結構特點和不同MCR亞型介導的效應,設計合成新的類似物將更具有應用于臨床的前景。本實驗室自主研制了α-MSH的新型類似物(專利授權號ZL200510026927.3,命名為STY39),是一種對MC1R與MC5R均具有高選擇性的激動劑。經(jīng)前期實驗已證明,STY39對LPS誘導

5、的內(nèi)毒素休克小鼠和博萊霉素誘導的急性肺部炎癥和肺纖維化大鼠具有很好的保護作用,能顯著抑制血管內(nèi)皮細胞表達組織因子而上調(diào)組織因子途徑抑制因子的表達,還能顯著下調(diào)晚期炎癥因子高遷移率族蛋白B1(HMGB1)的表達以有助于控制炎癥發(fā)展。
　　 樹突狀細胞(dendritic cells,DCs)是機體內(nèi)功能最強的專職抗原提呈細胞,承接固有免疫和適應性免疫,是啟動、調(diào)控和維持適應性免疫應答的關鍵。DCs的功能與其成熟狀態(tài)密切相關:成熟D

6、Cs能有效激活免疫應答,在抗腫瘤、抗感染免疫方面意義重大；而非成熟DCs具有致免疫耐受性,在防治移植排斥和自身免疫病方面具有重要意義。本課題組在探究α-MSH對DCs分化成熟的調(diào)控作用中,已明確α-MSH可以抑制人外周血單核細胞來源DCs的發(fā)育成熟,且提示可能與RORα蛋白表達增高相關。聯(lián)系已知關于RORα在抗炎過程中發(fā)揮的確切效應以及在細胞增殖分化中的作用,我們推測RORα亦可能參與DCs分化成熟的調(diào)控過程。因此本課題將深入研究ROR

7、α是否與DCs的分化發(fā)育有關,RORα在α-MSH調(diào)控DCs分化成熟中的作用與機制,迄今為止尚未見類似報道。本課題研究內(nèi)容共分為以下四個部分。
　　 第一部分α-MSH及其類似物STY39對DCs表達RORα的影響
　　 目的:探明不同濃度α-MSH或其類似物STY39作用與RORα表達量之間的關系。方法:利用體外分離培養(yǎng)的小鼠骨髓來源DCs作為研究對象,用50 ng/ml TNF-α刺激DCs(TNF-α-DCs),誘

8、導DCs成熟,再分別以不同濃度α-MSH或STY39(10-6 mol/L、10-8 mol/L、10-10 mol/L和10-12 mol/L)處理。然后于作用不同時間點,通過Westernblotting法和實時熒光定量RT-PCR法檢測RORα的蛋白和基因表達水平。結果:TNF-α-DCs中RORα蛋白和mRNA表達較對照組降低,在α-MSH(10-8、10-10 mol/L)或STY39(10-10 mol/L)作用后,RORα

9、蛋白和mRNA的表達量均明顯增加(P<0.05)。
　　 結論:α-MSH或STY39可以上調(diào)TNF-α刺激的小鼠骨髓來源DCs中RORα的表達。
　　 第二部分高表達RORα對TNF-α誘導DCs成熟的影響
　　 目的:觀察RORα在細胞內(nèi)高表達是否影響DCs的發(fā)育成熟。
　　 方法:首先構建rAAV-RORα-hrGFP重組質(zhì)粒并轉染TNF-α-DCs,獲得高表達RORα的DCs(rAAV-RORα-

10、hrGFP-TNF-α-DCs),然后觀察其表型變化和功能狀態(tài)。用流式細胞術(FCM)檢測DCs表型(Iab、CD86、CD54)；采用FITC-BSA吞噬實驗并經(jīng)FCM分析DCs吞噬抗原功能的變化;以3H-TdR摻入法測定DCs刺激抗原特異性T細胞增殖的能力；ELISA檢測DCs產(chǎn)生IL-6、IL-12、IL-10的水平。
　　 結果:與rAAV-IRES-hrGFP-TNF-α-DCs(空載體對照)相比,rAAV-RORα-

11、hrGFP-TNF-α-DCs呈現(xiàn)以下變化:①Iab、CD86、CD54分子的表達明顯下調(diào)；②吞噬FITC-BSA的功能增強(P<0.05)；③刺激抗原特異性T細胞增殖的能力明顯減弱(P<0.01)；④IL-6和IL-12的分泌減少(P<0.05),而IL-10的分泌水平明顯上升(P<0.01)。
　　 結論:使TNF-α刺激的DCs內(nèi)高表達RORα可以抑制DCs的發(fā)育成熟。
　　 第三部分 RORα生α-MSH及其類似

12、物STY39抑制DCs成熟中的作用
　　 目的:研究RORα在α-MSH或STY39抑制DCs成熟過程中的作用。
　　 方法:設計合成RORα的siRNAs,采用RNA干擾技術沉默TNF-α-DCs中RORα mRNA的表達,觀察10-10 mol/Lα-MSH或STY39作用后[即α-MSH(or STY39)-RORα-siRNA-TNF-α-DCs],是否改變其成熟狀態(tài)。測定指標包括:DCs的表型(Iab、CD86

13、、CD54)、吞噬功能、刺激抗原特異性T細胞增殖的能力以及產(chǎn)生IL-6、IL-12、IL-10的水平,方法同第二部分。
　　 結果:與α-MSH(or STY39)-non-siRNA-TNF-α-DCs(非特異性干擾對照組)相比,α-MSH(or STY39)-ROR-siRNA-TNF-α-DCs發(fā)生如下改變:①Iab、CD86、CD54分子的表達水平明顯增高；②吞噬BSA抗原的功能降低(P<0.05)；③刺激抗原特異性T細

14、胞增殖的能力增強(α-MSH,P<0.05；STY39,P<0.01)；④IL-6和IL-12的分泌水平升高(P<0.05),而IL-10的分泌減少(α-MSH,P<0.05；STY39,P<0.01)。
　　 結論:α-MSH或STY39抑制TNF-α-DCs成熟可能部分地通過誘導RORα高表達介導。
　　 第四部分RORα參與α-MSH及其類似物STY39抑制DCs成熟的機制
　　 目的:探討RORα參與α-

15、MSH及其類似物STY39抑制DCs成熟的相關信號轉導通路。
　　 方法:①將DCs分為:未成熟對照組(imDCs)、50 ng/ml TNF-α刺激組(TNF-α-DCs)、10-10 mol/Lα-MSH或STY39處理組[α-MSH(or STY39)+TNF-α-DCs]、rAAV-RORα-hrGFP-TNF-α-DCs組和rAAV-IRES-hrGFP-TNF-α-DCs(空載體對照)組,用實時熒光定量RT-PCR的

16、方法檢測不同處理組α-MSH的天然受體(MC-1～5R)的表達情況;②利用各種信號轉導通路特異性阻斷劑包括SB203580(p38/MAPK)、GF10933X(PKC)、H89(PKA)、PD98059(ERK1/ERK2)和PDTC(NF-κB)等分別作用于經(jīng)10-10 mol/Lα-MSH或STY39+TNF-α處理的DCs,然后采用實時熒光定量RT-PCR方法檢測各組RORα的mRNA表達情況;③通過Western blot檢測

17、TNF-α-DCs高表達RORα后細胞內(nèi)NF-κB p65和IκBα蛋白的表達情況；④采用雙熒光素酶報告基因法檢測TNF-α-DCs高表達RORα后以及STY39+TNF-α-DCs的RORα被干擾表達后NF-κB的轉錄活性。
　　 結果:①MC-1～5R可組成性表達于DCs,TNF-α作用后可上調(diào)MC1R和MC5R的表達量(P<0.01),下調(diào)MC3R和MC4R的表達量(P<0.05)；②α-MSH和STY39均能上調(diào)TNF-

18、α-DCs的MC1R表達(P<0.05),STY39還能上調(diào)imDCs的MC5R表達(P<0.05)；③細胞內(nèi)高表達RORα可使imDCs和TNF-α-DCs表達MC1R增加(P<0.05)；④經(jīng)α-MSH或STY39+TNF-α刺激的DCs,使用阻斷劑SB203580、GF10933X或H89作用后,RORα mRNA的表達量均明顯降低(P<0.01)；⑤高表達RORα可顯著減少TNFα-DCs胞核內(nèi)NF-κB p65蛋白含量、增加胞

19、漿內(nèi)IκBα蛋白含量,同時抑制NF-κB的轉錄活性(P<0.01)；干擾RORα表達的TNFα-DCs在STY39作用后,NF-κB轉錄活性明顯高于未干擾對照組(P<0.05)。
　　 結論:在α-MSH或STY39抑制TNF-α誘導DCs成熟的過程中,可由MCR介導通過多種信號轉導途徑(p38/MAPK、PKC、PKA)上調(diào)RORα在TNF-α-DCs中的表達。高表達RORα一方面通過上調(diào)IκBα蛋白表達量、抑制NF-κB的轉

20、核與轉錄活性,導致DCs的成熟信號轉導受阻；另一方面可誘導MCR表達以進一步增強起始信號,從而發(fā)揮抑制DCs分化成熟的作用。
　　 綜上所述,本課題發(fā)現(xiàn)RORα參與了DCs發(fā)育成熟的調(diào)控；在α-MSH或其類似物STY39抑制TNF-α誘導DCs成熟的過程中,RORα發(fā)揮了非常關鍵的作用；α-MSH或STY39可通過MCR介導下游多種信號轉導通路(如p38/MAPK、PKC、PKA等)使RORα的表達增加,并使TNF-α刺激的DC