齊墩果酸誘導(dǎo)A549細胞凋亡蛋白質(zhì)組差異表達分析及細胞內(nèi)外藥物含量測定.pdf

1、目的:齊墩果酸在臨床上被廣泛用于治療肝炎,近年的研究發(fā)現(xiàn)其還有免疫雙向調(diào)解作用、抗炎抗病毒及抗癌活性等,療效甚好,但其作用機制尚不明確。本研究采用MTT法,流式細胞法等證實OA對A549細胞具有增殖抑制作用。進一步用HPLC法測定細胞內(nèi)外OA的含量,考察相同藥物濃度與A549不同的作用時間和不同藥物濃度作用相同時間后細胞內(nèi)外的OA含量變化,以研究OA在A549細胞內(nèi)的動態(tài)作用。再結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)的方法對OA誘導(dǎo)人肺癌細胞A549做比較蛋白

2、質(zhì)組學(xué)分析,監(jiān)測藥物在作用過程中,人肺癌細胞A549蛋白質(zhì)的變化,以期能從分子水平尋找出可能介導(dǎo)OA作用的靶點、生物分子,推測OA的可能作用機制,為該藥在臨床上的應(yīng)用提供理論和實驗數(shù)據(jù)。
　　 方法:1、建立了OA對A549細胞的增殖凋亡的研究模型。培養(yǎng)A549細胞,并用MTT法觀察了OA對A549細胞的生長抑制效應(yīng),流式細胞儀檢測藥物作用后細胞凋亡的情況,用DAPI染色法觀察了藥物作用前后細胞的形態(tài)學(xué)變化和熒光強度的變化。

3、r>　　 2、建立了細胞內(nèi)外OA的HPLC定量研究法。細胞經(jīng)藥物作用后分別收集細胞內(nèi)外液,然后通過HPLC來進行定量分析。HPLC分析色譜條件是:色譜柱為Hypersil ODS(4.6 mm×250 mm,5μm):流動相為甲醇-水(pH3.38)=90:10(V/V);流速為1.0 ml/min;柱溫是30℃:檢測波長為210nm;進樣量20μl。
　　 3、分別提取空白細胞和OA作用后的細胞的總蛋白質(zhì),采用雙向凝膠電泳技

4、術(shù)(2-DE)分離蛋白質(zhì),得到的凝膠用硝酸銀染色,PDQuest軟件分析識別差異表達蛋白質(zhì)。膠內(nèi)酶切差異蛋白點,用基質(zhì)輔助激光解吸離子飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)分析酶切的蛋白點,得到的肽質(zhì)量指紋圖譜(PMF)在Mascot軟件的數(shù)據(jù)庫中進行查詢驗證。
　　 結(jié)果:1、通過MTT方法證實了在10-200μg/ml的范圍內(nèi),OA對A549細胞的增殖抑制作用明顯,并且在200μg/ml時能達到80％的抑制率,呈時間和濃度

5、依賴性關(guān)系,24、48、72h的IC50值為109.45、80.08、78.21μg/ml。通過DAPI染色后觀察細胞核的形態(tài)變化,可以觀察到OA作用24h以后,A549的細胞核出現(xiàn)形態(tài)異常,在小劑量80μg/ml時細胞染色質(zhì)固縮,形成很多顆粒物質(zhì),或者細胞核破裂形成碎片,熒光強度增加,細胞凋亡開始發(fā)生,高濃度(200μg/ml)時伴有明顯的細胞凋亡現(xiàn)象。流式細胞儀檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)OA在80、120、200μg/ml時對A549細胞的增殖抑

6、制作用與MTT實驗結(jié)果相符,各組總凋亡率(n=3,X±S)(%)分別為:16.37±2.17,40.97±2.72,86.14±1.43,與對照組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。
　　 2、在上述色譜條件下細胞內(nèi)液中OA在1.02～20.4μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.9996),平均回收率為97.57%,日內(nèi)精密度的RSD分別為3.03%,2.56%,1.99%,日間精密度的RSD分別為2.42%,1.79%,2.5

7、9%;細胞外液中OA在5.1～81.6μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.9998),平均回收率為97.37%,日內(nèi)精密度的RSD為0.63%,1.99%,2.36%,日間精密度的RSD為3.52%,1.19%,1.21%,表明精密度良好。
　　 3、通過雙向電泳后得到的凝膠圖經(jīng)PDQuest8.0軟件分析后,檢測到的蛋白點約有1000個,選取其中二倍以上有顯著性差異的蛋白點酶解后進行MALDI-TOF-MS分析,經(jīng)數(shù)據(jù)庫查詢

8、后,鑒定出4個有統(tǒng)計學(xué)意義的蛋白點(p＜0.05),其中下調(diào)的蛋白有TPx-1、Actin和BTF3,上調(diào)的蛋白有Hsp27。
　　 結(jié)論:通過MTT實驗,DAPI染色實驗和流式細胞術(shù)證明了OA對A549細胞有增殖抑制作用,并且通過分析細胞內(nèi)外藥物濃度的變化初步探討了OA在細胞內(nèi)的動態(tài)機制,再經(jīng)過質(zhì)譜分析和生物信息學(xué)檢索在空白細胞組和藥物處理組的2-DE圖譜中表達差異的蛋白質(zhì)斑點,初步鑒定出4種蛋白質(zhì),提示這些蛋白可能與OA的抗