HCPT誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡前后線粒體-核蛋白質(zhì)組變化的定量分析.pdf

1、目的： 建立羥基喜樹堿(Hydroxycamptothecin，HCPT)誘導(dǎo)的肝癌SMMC-7721細(xì)胞線粒體凋亡模型，應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)分析的電泳法策略和鳥槍法策略鑒定細(xì)胞凋亡前后的線粒體差異表達(dá)蛋白質(zhì)和細(xì)胞核差異表達(dá)蛋白質(zhì)，為從亞細(xì)胞器蛋白質(zhì)組水平進(jìn)一步闡明HCPT誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生凋亡的機(jī)理奠定基礎(chǔ)，同時(shí)建立并完善基于穩(wěn)定同位素標(biāo)記的親和標(biāo)簽標(biāo)記法(cICAT)的亞細(xì)胞器定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)平臺(tái)。 策略與方法 1

2、.確定肝癌細(xì)胞線粒體凋亡時(shí)相：用HCPT處理肝癌SMMC-7721細(xì)胞，通過(guò)光鏡、MTT實(shí)驗(yàn)、電鏡、流式細(xì)胞儀和AO/EB雙染等方法分別在定性、定量、早期與晚期等不同層面上檢測(cè)HPCT的致腫瘤細(xì)胞凋亡活性；通過(guò)線粒體跨膜電位、激光共聚焦與western blot法等檢測(cè)線粒體凋亡的時(shí)相變化，從而確定線粒體凋亡時(shí)相。 2.線粒體分離與純度鑒定：用線粒體組分分離試劑盒分離肝癌SMMC-7721細(xì)胞線粒體，用詹納斯綠B染料對(duì)分離的線粒

3、體進(jìn)行染色鑒定；分別用核組蛋白Histone、細(xì)胞骨架蛋白β-actin、組織蛋白酶Cathepsin-D和熱休克蛋白HSP60作為細(xì)胞核、細(xì)胞漿、溶酶體和線粒體的特異標(biāo)志蛋白，用western blot對(duì)分離的線粒體進(jìn)行純度鑒定；分別用琥珀酸脫氫酶作為線粒體純度的指標(biāo)、NADPH-細(xì)胞色素C還原酶作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)含量的指標(biāo)、5-核苷酸酶作為細(xì)胞膜含量的指標(biāo)，通過(guò)測(cè)定酶比活力的方法對(duì)分離的線粒體進(jìn)行純度鑒定。 3.應(yīng)用雙向電泳/基質(zhì)輔助激光解

4、吸離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜( two-dimensional electrophoresis/matrix assisted laserdesorption/isonization time of flying mass spectrometry,2DE-MALDI-TOF/MS)技術(shù)路線分析細(xì)胞凋亡前后的線粒體差異表達(dá)蛋白譜：通過(guò)優(yōu)化各種條件參數(shù)來(lái)確定合適的樣品上樣量、染色方法與膠條種類；根據(jù)蛋白質(zhì)溶解度不同將線粒體蛋白分成三個(gè)組分，分別對(duì)

5、三個(gè)組份進(jìn)行雙向電泳分離，用PDquest(7.0)軟件分析掃描的二維凝膠電泳圖像，篩選出細(xì)胞凋亡前后的差異表達(dá)蛋白斑點(diǎn)；候選差異表達(dá)蛋白斑點(diǎn)經(jīng)膠內(nèi)胰酶酶解，MALDI-TOF/MS分析，得到肽指紋圖譜(peptide mass fingerprinting，PMF)，使用Mascot和Peptldent軟件分別在MSDB和SWISS-PROT數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索鑒定差異表達(dá)蛋白質(zhì)，并對(duì)差異蛋白質(zhì)進(jìn)行生物信息學(xué)分析。 4.應(yīng)用基于二維液

6、相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜(two-dimensional liquidchromatography/tandem mass spectrometry，2D-LC/MS/MS)的可裂解的穩(wěn)定同位素標(biāo)記的親和標(biāo)簽(cleavable isotope-coded affinity tag，c-ICAT)方法定量分析細(xì)胞凋亡前后線粒體蛋白質(zhì)組的表達(dá)差異：分別對(duì)線粒體中等溶解度蛋白組份和線粒體疏水蛋白組份進(jìn)行c-ICAT定量蛋白質(zhì)組分析。蛋白樣品經(jīng)過(guò)c-

7、ICAT試劑標(biāo)記、酶解、強(qiáng)陽(yáng)離子交換色譜/親和色譜純化標(biāo)記肽、裂解去除生物素親和標(biāo)簽、μRP-HPLC MS/MS分析，根據(jù)肽的洗脫峰面積得到同一種蛋白質(zhì)在HCPT促肝癌細(xì)胞凋亡前后的線粒體中表達(dá)量變化的準(zhǔn)確信息、根據(jù)MS/MS分析結(jié)果進(jìn)行測(cè)序獲得到蛋白質(zhì)的鑒定信息。并對(duì)表達(dá)量有顯著差異的蛋白質(zhì)進(jìn)行生物信息學(xué)分析。 5.細(xì)胞核純度鑒定及細(xì)胞凋亡前后細(xì)胞核蛋白質(zhì)組表達(dá)差異的定量分析：用細(xì)胞組分分離試劑盒分離獲取肝癌SMMC-7721細(xì)胞核

8、組份；分別用熱休克蛋白HSP60、細(xì)胞骨架蛋白β-actin、核組蛋白Histone和組織蛋白酶Cathepsin-D作為線粒體、細(xì)胞漿、細(xì)胞核和溶酶體的特異標(biāo)志蛋白，用western blot對(duì)分離的細(xì)胞核進(jìn)行純度鑒定。用c-ICAT試劑標(biāo)記提取的核蛋白質(zhì)，經(jīng)過(guò)標(biāo)記、酶解、色譜純化、裂解等過(guò)程，采用μRP-HPLC MS/MS在線分析，根據(jù)定量積分肽的洗脫峰面積得到同一種蛋白質(zhì)在HCPT促肝癌細(xì)胞凋亡前后的細(xì)胞核中表達(dá)量變化的準(zhǔn)確信息

9、、根據(jù)MS/MS分析結(jié)果測(cè)序獲得到蛋白質(zhì)的鑒定信息。并對(duì)表達(dá)量有顯著差異的蛋白質(zhì)進(jìn)行生物信息學(xué)分析。 結(jié)果： 1.HCPT對(duì)肝癌SMMC-7721細(xì)胞的增殖有明顯抑制作用，半數(shù)抑制濃度(50％inhibitory concentration，IC50)約為80μg/ml。當(dāng)用80μg/mlHCPT對(duì)細(xì)胞處理不同時(shí)間后，細(xì)胞可發(fā)生一系列形態(tài)學(xué)和生化性質(zhì)的變化：細(xì)胞膜的磷脂酰絲氨酸外翻，細(xì)胞核染色質(zhì)固縮、呈致密濃染的凋亡狀態(tài)

10、，超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)線粒體出現(xiàn)了腫脹性變化，線粒體跨膜電位下降，并且Cytc從線粒體釋放至細(xì)胞漿。 2.電鏡觀察染色結(jié)果：分離的線粒體經(jīng)詹納斯綠B染色后，呈藍(lán)綠色的顆粒狀或棒狀結(jié)構(gòu)；western blot結(jié)果表明：提取的線粒體組分檢測(cè)到了線粒體標(biāo)志蛋白HSP60，沒有檢測(cè)到細(xì)胞核標(biāo)志蛋白Histone、細(xì)胞漿標(biāo)志蛋白β-actin與溶酶體標(biāo)志蛋白Cathepsin-D；酶比活力測(cè)定結(jié)果顯示：提取的線粒體組分與細(xì)胞勻漿相比較，琥珀酸脫氫酶

11、比活力提高13.8倍，NADPH-細(xì)胞色素C還原酶和51-核苷酸酶在線粒體組分中的比活力很低。 3.優(yōu)化條件試驗(yàn)確定：最合適的樣品上樣量為200μg、最佳染色方法為銀染、最佳膠條為非線性pH3-10膠條。通過(guò)對(duì)細(xì)胞線粒體凋亡前后的二維凝膠電泳圖像進(jìn)行對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)約有39個(gè)蛋白斑點(diǎn)表達(dá)有差異，對(duì)其中25個(gè)差異蛋白斑點(diǎn)進(jìn)行MALDI-TOF/MS分析后，鑒定出了20種可能的差異表達(dá)蛋白。 4.對(duì)細(xì)胞凋亡前后線粒體中等溶解度

12、蛋白組份的c-ICAT分析結(jié)果顯示：分析鑒定了91種蛋白質(zhì)，獲得了在細(xì)胞凋亡前后其相對(duì)表達(dá)量差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的蛋白質(zhì)74種，其中，42種蛋白質(zhì)在細(xì)胞凋亡后的表達(dá)量下調(diào)，32種蛋白質(zhì)的表達(dá)量在凋亡細(xì)胞中上調(diào)。 5.對(duì)細(xì)胞凋亡前后線粒體疏水蛋白組份的c-ICAT分析結(jié)果顯示：分析鑒定了244種蛋白質(zhì)，獲得了154種蛋白質(zhì)在細(xì)胞凋亡前后的相對(duì)表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中，12種蛋白質(zhì)在凋亡細(xì)胞中的表達(dá)量下調(diào)，137種蛋白質(zhì)的表達(dá)量

13、在凋亡細(xì)胞中上調(diào)，5種蛋白質(zhì)的表達(dá)量沒有變化。鑒定的蛋白質(zhì)中有13種強(qiáng)堿性蛋白質(zhì)，分子量大于200KDa的11種蛋白質(zhì)和小于10KDa的6種蛋白質(zhì)，50種膜蛋白質(zhì)，表達(dá)量改變10倍以上的蛋白質(zhì)有45種。 6.提取的細(xì)胞核組分檢測(cè)到了細(xì)胞核標(biāo)志蛋白Histone，沒有檢測(cè)到線粒體標(biāo)志蛋白HSP60、細(xì)胞漿標(biāo)志蛋白β-actin與溶酶體標(biāo)志蛋白Cathepsin-D。對(duì)細(xì)胞凋亡前后細(xì)胞核蛋白組份的c-ICAT分析結(jié)果顯示：分析鑒定了94種蛋

14、白質(zhì)，獲得了相對(duì)表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的蛋白質(zhì)43種，其中，12種蛋白質(zhì)在細(xì)胞凋亡后的表達(dá)量下調(diào)，30種蛋白質(zhì)的表達(dá)量在凋亡細(xì)胞中上調(diào)，1種蛋白質(zhì)的表達(dá)量沒有變化。 結(jié)論： 1.HCPT可通過(guò)Cytc依賴的線粒體途徑誘導(dǎo)癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。 2.三種線粒體純度鑒定試驗(yàn)均說(shuō)明：提取的細(xì)胞器組份是線粒體并且線粒體純度較高，可用于后續(xù)的蛋白質(zhì)組分析。 3.采用2DE-MALDI-TOF/MS技術(shù)路線鑒定出的線粒體中

15、20種差異表達(dá)蛋白可能在HCPT誘導(dǎo)的線粒體凋亡途徑中起重要作用。 4.細(xì)胞凋亡前后線粒體中等溶解度蛋白質(zhì)組中表達(dá)量差異蛋白的分子功能主要與能量代謝、核酸的翻譯、轉(zhuǎn)錄、復(fù)制以及細(xì)胞骨架有關(guān)。 5.細(xì)胞凋亡前后線粒體疏水蛋白質(zhì)組中表達(dá)量差異蛋白的分子功能主要與能量代謝，細(xì)胞結(jié)構(gòu)，核酸代謝，核糖體，細(xì)胞分裂增殖、分化凋亡，以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。 6.細(xì)胞凋亡前后細(xì)胞核蛋白質(zhì)組中表達(dá)量差異蛋白的分子功能主要與細(xì)胞增殖、凋亡