苧麻炭疽病菌的分離鑒定及抗病基因文庫的構(gòu)建.pdf

1、苧麻(Bochmeria nivea L.)為蕁麻科(Vrticaceae)苧麻屬(Bochmeria)多年生宿根性韌皮纖維作物。苧麻炭疽病(Colletotrichum spp.)是苧麻上發(fā)生普遍而嚴重的病害之一,一般發(fā)病率為20％～40％,重的病葉率、病情指數(shù)分別達90％、55.0％,可造成纖維損失10％左右。國內(nèi)外有關苧麻炭疽病的研究報道比較少,尤其是國外。在中國,苧麻炭疽病的研究大多集中在上世紀八九十年代。因為炭疽菌屬分類系統(tǒng)上

2、發(fā)生過變化,所以作為引起苧麻炭疽病的病原需要重新確認。解析苧麻炭疽病病菌的分類地位、生物學特性以及苧麻受炭疽病誘導后的抗病防御反應機理,對創(chuàng)建具廣譜持久的抗炭疽病材料,以及從苧麻中克隆抗病基因等具有重要意義。
　　 本研究的主要內(nèi)容為:分離和鑒定苧麻炭疽菌病病原,對病原菌的生物學特性及多態(tài)性進行研究；應用抑制差減雜交技術(SSH)構(gòu)建病原誘導后特異表達的cDNA文庫；從該SSHcDNA文庫中篩選出與苧麻抗病相關的特異表達和增強表

3、達的基因片段；通過GenBank數(shù)據(jù)庫檢索,獲得差異表達片段可能的生物學信息。最后進一步分析和推測這些片段在抗病反應中的作用和與抗病的關系。了解苧麻炭疽病水平抗性所涉及的信號傳導、參與抗病相關基因的表達種類與數(shù)量。初步建立苧麻炭疽病病水平抗性相關基因的表達譜:為后續(xù)基因克隆、基因功能和抗病機理的深入研究建立技術平臺。
　　 取得的主要研究結(jié)果如下:
　　 1.本研究從幾個苧麻主產(chǎn)區(qū)(湖北武漢、湖北咸寧、湖南長沙、江西宜春

4、和四川達州)采集炭疽病菌感染組織。已經(jīng)成功分離到苧麻炭疽病菌株89個,分別為:湖北武漢20個,咸寧24個,江西18個,湖南長沙21個,四川達州6個。通過形態(tài)學和分子鑒定(ITS區(qū)序列,β-tubulin序列和Actin序列的克隆)最后初步鑒定出苧麻炭疽菌病原為Colletotrichum gloeosporioides,C.fructicola,C siamense和Chigginsianum。
　　 2.用UPGMA平均聚類法

5、對45個分離自各產(chǎn)區(qū)的苧麻炭疽菌菌株進行RAPD聚類分析,發(fā)現(xiàn)不同地域間和同一地域里,苧麻炭疽菌菌株間存在豐富的遺傳多樣性。在相似水平60％,供試菌株可以分為兩大類:第一類,WH-4、XN2-1、XN2-4。第二類,WH-1、WH-9、WH-A、WH-B、WH-C、WH-D、WH-H、WH-J、JB-1、XN1-1、XN1-6、XN2-1、XN2-4、XN3-3、XN3-4、XN4-1、XN5、JX-1、JX-4、JX-6、JX-12、

6、JX-14、JX-15、JX-16、JX-17、JX—18、JX-19、DZ-2、DZ-3、DZ-4、DZ-5、DZ-6、HN-1、HN-2、HN-3、HN-7、HN-8、HN-9、HN-12、HN—13。
　　 3.代表性菌株HN-3(Colletotrichum gloeosporioides)生物學特性研究表明,菌絲在20～30℃之間可以生長,最適溫度為25℃。分生孢子在20℃～30℃之間產(chǎn)量較高,28℃達到最高。菌絲在p

7、H4.0-10.0均能生長,在PDA、PSA和苧麻葉片培養(yǎng)基上生長最快。在牛肉膏培養(yǎng)基上產(chǎn)孢最多。菌絲對各種碳源的利用率都很高。其中對麥芽糖的利用效果最好。產(chǎn)孢方面,相同的氮源,碳源不同其產(chǎn)孢量差異很大,硝酸鉀和葡萄糖的結(jié)合可以誘導大量孢子的產(chǎn)生,添加硝酸鈣菌絲生長最快,在酵母膏為氮源的培養(yǎng)基里菌落直徑較小,但是孢子數(shù)目巨大。維生素B2液體培養(yǎng)基里可以產(chǎn)生最多的生物量,同時也可以誘導大量分生孢子的產(chǎn)生。菌落在12小時光暗交替條件下生長最

8、快,但是孢子產(chǎn)量卻最低,而連續(xù)黑暗培養(yǎng)更利于孢子的生成。
　　 4.用抑制差減雜交技術(SSH)構(gòu)建了一個富集炭疽病抗性相關基因片段的差減文庫。應用反向Northern技術對該差減文庫進行了篩選。篩選出的差異表達克隆經(jīng)測序后合并為132個代表不同基因的EST片段。檢索結(jié)果表明,在能找到與之對應的EST序列中,就EST來源來看,得分最高的一大部分來源于楊屬、李屬、蓖麻、葡萄樹,其他也有來自大豆和長春花等。本實驗所得到的所有ESTs

9、,都沒有在苧麻中報道過?？共〖胺烙嚓P序列最多,為37條,占28％；未分類序列23條,占17％；未明確分類序列有15條,約占11％；轉(zhuǎn)錄相關10條,占8％:轉(zhuǎn)運相關和代謝相關都是7條,占5％；細胞生長及分化、蛋白質(zhì)合成和轉(zhuǎn)座子相關各有6條,占4％,另外還有與胞內(nèi)運輸相關的4條、能量相關的3條、信號傳導相關的3條、蛋白質(zhì)降解及貯藏相關和細胞結(jié)構(gòu)相關的2條和次生代謝相關序列有1條。其中抗病相關基因中包括來自白楊樹受銹病誘導的SSH文庫的相關