應(yīng)激致心肌細(xì)胞凋亡過(guò)程中TR3移位線粒體的分子調(diào)控機(jī)制.pdf

1、目的：認(rèn)識(shí)應(yīng)激條件下心肌細(xì)胞中MAPK信號(hào)通路活化，和Hsp70表達(dá)水平的改變對(duì)TR3核輸出和移位線粒體的影響，揭示應(yīng)激所致心肌細(xì)胞凋亡過(guò)程中TR3移位線粒體的分子機(jī)制，為闡明應(yīng)激機(jī)體心肌損傷的分子機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。
　　 方法：以10-5mol/L糖皮質(zhì)激素(GC)誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，建立離體心肌細(xì)胞應(yīng)激損傷實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?；采用酶?biāo)儀檢測(cè)離體細(xì)胞模型中Caspase3酶的活性，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡率，用Hochest33342

2、染色鑒定心肌細(xì)胞凋亡情況，用MTT法(四唑鹽比色法)測(cè)定心肌細(xì)胞存活率。采用Western blotting方法和免疫沉淀法觀察模型中MAPK家族的三個(gè)成員JNK、ERK1/2、p38以及TR3的蛋白表達(dá)和磷酸化水平；應(yīng)用SP600125、PD98059、SB203580分別調(diào)控JNK、ERK1/2和p38的磷酸化水平，觀察其對(duì)TR3磷酸化水平及線粒體移位的影響。用Hsp70表達(dá)的化學(xué)抑制劑KNK437調(diào)控Hsp70表達(dá)水平，采用Wes

3、tern blotting方法觀察離體細(xì)胞模型中Hsp70表達(dá)水平變化。
　　 結(jié)果：10-5mol/L GC作用于心肌細(xì)胞24小時(shí)后，細(xì)胞中Caspase3酶活性明顯增強(qiáng)；心肌細(xì)胞凋亡率顯著升高；Hochest33342染色能檢測(cè)到心肌細(xì)胞凋亡過(guò)程中出現(xiàn)的胞核中斷裂的DNA片段；心肌細(xì)胞存活率顯著下降。GC干預(yù)心肌細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)MAPK信號(hào)網(wǎng)絡(luò)顯著活化，其中JNK磷酸化水平在GC作用10min至60min時(shí)明顯升高，ERK1/

4、2磷酸化水平20min至60min時(shí)顯著升高，而p38磷酸化水平未見(jiàn)明顯變化。TR3磷酸化水平在40min至60min時(shí)可見(jiàn)明顯升高。抑制JNK磷酸化后，TR3磷酸化水平明顯降低，線粒體中TR3含量亦明顯減少；并繼而導(dǎo)致Caspase3酶的活性顯著下降，心肌細(xì)胞凋亡率顯著下降，心肌細(xì)胞存活率顯著升高。但抑制ERK1/2磷酸化，并未發(fā)現(xiàn)TR3磷酸化水平明顯變化。以上結(jié)果表明應(yīng)激心肌細(xì)胞中活化的JNK信號(hào)通路對(duì)TR3磷酸化和移位線粒體有重要

5、促進(jìn)作用。進(jìn)一步觀察應(yīng)激心肌細(xì)胞中Hsp70對(duì)TR3移位線粒體的影響，可發(fā)現(xiàn)應(yīng)激導(dǎo)致心肌細(xì)胞Hsp70表達(dá)水平顯著升高，促進(jìn)Hsp70與TR3的相互作用。用KNK437抑制應(yīng)激心肌細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)的Hsp70后，可見(jiàn)TR3向線粒體移位明顯受抑，線粒體中TR3含量亦明顯減少。但未見(jiàn)心肌細(xì)胞中Caspase3酶的活性明顯下降及細(xì)胞凋亡率的受抑；心肌細(xì)胞存活率亦未明顯升高；提示應(yīng)激心肌細(xì)胞中高表達(dá)的Hsp70雖可促進(jìn)TR3向線粒體移位，但可能通過(guò)