亞硫酸氫鈉誘導(dǎo)H9C2心肌細(xì)胞線粒體損傷及凋亡的分子機(jī)制研究.pdf

1、SO2是大氣中主要污染物之一，SO2吸入后所引起的心血管系統(tǒng)疾病也正受到廣泛的關(guān)注。有資料顯示SO2吸入增加了心血管疾病的發(fā)生率和死亡率。本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)，SO2及其衍生物NaHSO3可誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)及功能的紊亂，表現(xiàn)為線粒體膜電位、細(xì)胞色素C氧化酶活性及ATP含量降低。與此同時(shí)，線粒體DNA(mtDNA)含量減少，線粒體DNA編碼的氧化磷酸化復(fù)合體亞基mRNA表達(dá)降低，調(diào)控線粒體DNA的過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ輔

2、激活因子1α(PGC-1α)，核呼吸因子(NRF1)和線粒體轉(zhuǎn)錄因子(TFAM)的表達(dá)也降低。然而，SO2及其衍生物是否通過(guò)PGC-1α-NRF1-TFAM-mtDNA-mtRNA-ATP這一信號(hào)途徑來(lái)誘導(dǎo)線粒體功能的紊亂尚不確定。
　　為此，首先構(gòu)建了NRF1-pcDNA3.1及TFAM-pcDNA3.1重組質(zhì)粒，并將其在H9C2細(xì)胞中瞬時(shí)高表達(dá)后，再用100μM的NaHSO3處理H9C2心肌細(xì)胞24h，之后分別采用Wester

3、n blot檢測(cè)NRF1及TFAM的表達(dá)情況，采用熒光定量RT-PCR技術(shù)檢測(cè)線粒體氧化磷酸化復(fù)合體Ⅳ亞基中由mtDNA編碼的CO3的mRNA表達(dá)情況，采用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)ATP含量。來(lái)驗(yàn)證NRF1及TFAM在PGC-1α-NRF1-TFAM-mtDNA-mtRNA-ATP這一信號(hào)通路中的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)NRF1后，NRF1和TFAM的蛋白表達(dá)水平均升高，高表達(dá)TFAM后TFAM的蛋白表達(dá)水平也升高。與此同時(shí)，由mtDNA編碼的復(fù)合

4、體Ⅳ亞基CO3的mRNA水平也比NaHSO3處理組升高。兩種蛋白的高表達(dá)均可以減輕NaHSO3導(dǎo)致的H9C2細(xì)胞線粒體功能障礙，表現(xiàn)為ATP含量升高。
　　此外，采用100μM的NaHSO3對(duì)大鼠H9C2心肌細(xì)胞進(jìn)行不同時(shí)間(0，3，6，12，24h)的體外染毒。采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞中ROS產(chǎn)生情況，發(fā)現(xiàn)NaHSO3可誘導(dǎo)ROS時(shí)間依賴性升高。用5mMN-乙酰-L-半胱氨酸(NALC)處理H9C2心肌細(xì)胞后，再用100μM的Na

5、HSO3處理24h，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的ROS含量，采用熒光定量RT-PCR技術(shù)檢測(cè)調(diào)控線粒體氧化磷酸化功能的核轉(zhuǎn)錄因子TFAM的mRNA表達(dá)情況，采用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)ATP含量。發(fā)現(xiàn)NALC可以阻止NaHSO3誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞ATP含量降低、ROS含量升高以及TFAM轉(zhuǎn)錄水平降低這些現(xiàn)象的發(fā)生。
　　最后，采用100μM的NaHSO3對(duì)大鼠H9C2心肌細(xì)胞進(jìn)行不同時(shí)間(0，3，6，12，24h)的體外染毒后，采用流式細(xì)胞儀檢

6、測(cè)細(xì)胞凋亡情況，采用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白（cytc，bax和p53）的表達(dá)情況，采用分光光度法測(cè)caspase-3活性采用Western blot技術(shù)檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白(cleaved caspase-3,cleaved caspase-9,p53，p53-ser15，bcl-2和bax)的表達(dá)情況。結(jié)果表明，不同時(shí)間NaHSO3處理H9C2細(xì)胞后，心肌細(xì)胞產(chǎn)生凋亡現(xiàn)象caspase-3活性升高;cytc、cleaved c