綿羊Myostatin基因shRNA慢病毒載體的構(gòu)建與鑒定.pdf

1、本研究的目的是構(gòu)建綿羊myostatin基因 RNA干擾(RNAi)慢病毒載體，并評估其對myostatin基因表達(dá)的沉默效果。方法是，在Genebank中檢索目的基因的序列，獲得sheep的myostatin的序列，根據(jù)ambion的shRNA設(shè)計(jì)系統(tǒng)，設(shè)計(jì)、合成4對針對myostatin基因shRNA干擾載體。合成全基因序列，將合成好的全基因序列裝入pMD-18T載體并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH5a，測序驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)有突變點(diǎn)，通過重疊PCR將

2、基因序列中突變點(diǎn)修復(fù)，將突變后的全長片段用XhoI和EcoRI酶切后連接至目的載體pCDNA3.1(+)，并轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞DH5a中，經(jīng)測序驗(yàn)證，重組克隆中插入片段序列與目的基因序列完全一致，高效表達(dá)載體構(gòu)建成功。用Lipofeetamine2000將pcDNA3.1-Ovis aries MSTN質(zhì)粒、shRNA 干擾載體共轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞,48h后取一部分細(xì)胞做qPCR，通過qPCR檢測細(xì)胞樣品中目的基因和內(nèi)參基因的表達(dá)量，

3、采用△△Ct的方法進(jìn)行相對定量，使用轉(zhuǎn)染陰性干擾載體的樣品作為對照樣品，比較各瞬時(shí)轉(zhuǎn)染干擾載體組樣品目的基因的表達(dá)，并計(jì)算干擾效果，shRNA-86C的干擾效果最好，基因沉默效率60.13％，對shRNA-86C進(jìn)行慢病毒包裝。將雙鏈的shRNA oligo插入到shRNA表達(dá)載體pENTR?/U6 vector中，構(gòu)建shRNA表達(dá)質(zhì)粒，使用Invitrogen公司的LR重組系統(tǒng)將pENTR/U6-85-C與慢病毒載體pLenti6/

4、BLOCK-iT-DEST進(jìn)行重組。用Lipofeetamine2000將構(gòu)建的慢病毒表達(dá)載體 pL-85-C和包裝質(zhì)粒（Packaging Mix）共轉(zhuǎn)染至生長狀態(tài)良好，處于對數(shù)生長期的293T細(xì)胞,48h后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清,3000rpm 離心10 min，去除細(xì)胞和碎片，并用0.45um的濾器過濾，將病毒原液在50000g下超速離心2小時(shí)，去除上清，重懸于500 μl DMEM培養(yǎng)液中，病毒感染細(xì)胞HEK293細(xì)胞，在倒置顯微鏡下