關(guān)鍵信號轉(zhuǎn)導通路在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者中的多組學和功能研究.pdf

1、研究背景：
　　系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是一種累及多器官、多系統(tǒng)、病程遷延反復(fù)的自身免疫性疾病。過去十年間，學者們對 SLE的發(fā)病機制進行了研究，發(fā)現(xiàn)在SLE患者中，多個生物分子在基因mRNA、蛋白質(zhì)和（或）代謝物層面上表達異常。雖然這些發(fā)現(xiàn)加深了人們對SLE發(fā)病機制的了解，但是，單純研究個別分子無法解釋復(fù)雜的生物學反應(yīng)。隨著科學技術(shù)的發(fā)展，科學家發(fā)明了轉(zhuǎn)錄組、蛋白組和代謝

2、組等組學技術(shù)，這種技術(shù)可以鑒定出組織、血液等復(fù)雜樣本中盡可能多的生物分子并定量，根據(jù)病例對照研究的思路，尋找不同組別樣本的差異分子，再對這些差異分子進行生物信息學分析。基因本體（gene ontology，GO）富集分析和京都基因與基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析是常用的生物信息學分析方法，前者給出與生物分子相關(guān)的生物學反應(yīng)，后者給出了生物分子參與的信號轉(zhuǎn)

3、導通路。
　　組學的研究目標往往是特定類別的生物分子，例如，轉(zhuǎn)錄組的研究目標為基因mRNA；蛋白組的研究目標為蛋白質(zhì)；代謝組的研究目標為代謝物。但是，生物學反應(yīng)往往是基因 mRNA、蛋白組和代謝物共同作用的結(jié)果。因此，整合不同平臺的組學數(shù)據(jù)成為必要的工作。轉(zhuǎn)錄組與蛋白組表達數(shù)據(jù)的關(guān)聯(lián)研究是一種思路，它通過比較、分析基因mRNA和蛋白質(zhì)的表達量，實現(xiàn)數(shù)據(jù)互補。整合轉(zhuǎn)錄組、蛋白組和代謝組KEGG富集分析數(shù)據(jù)是另一種思路，它為探索疾病的

4、發(fā)病機制提供了新的方法。
　　凝血通路和補體通路是機體免疫系統(tǒng)重要的組成部分。近年來，研究發(fā)現(xiàn)凝血通路和補體通路相互調(diào)節(jié)、彼此影響。兩條通路的相互作用通常通過兩種方式實現(xiàn)：（1）凝血因子和補體因子直接彼此活化；（2）以炎癥因子為橋梁，凝血因子和補體因子相互調(diào)節(jié)。在敗血癥、血栓等疾病中，凝血通路和補體通路的相互作用與病程的發(fā)展密切相關(guān)。而相關(guān)報道在SLE患者中還非常有限。
　　因此，本研究擬利用轉(zhuǎn)錄組、蛋白組和代謝組技術(shù)，檢測

5、 SLE患者和健康人群中基因mRNA、蛋白質(zhì)和代謝物的表達量，進而鑒定出SLE患者與健康人群之間表達差異的分子，并對這些分子進行生物信息學分析。本研究還將整合轉(zhuǎn)錄組和蛋白組中生物分子表達量數(shù)據(jù)，進行基因mRNA和蛋白質(zhì)表達關(guān)系的關(guān)聯(lián)研究；整合轉(zhuǎn)錄組、蛋白組和代謝組中KEGG數(shù)據(jù)，尋找SLE發(fā)病機制中關(guān)鍵信號轉(zhuǎn)導通路；探討這條通路與SLE患者疾病活動度的關(guān)系。
　　研究一：SLE患者轉(zhuǎn)錄組、蛋白組和代謝組研究
　　目的：

6、>　　鑒定 SLE患者中表達異常的基因 mRNA、蛋白組和代謝物，探討這些分子參與的生物學反應(yīng)和信號轉(zhuǎn)導通路。
　　方法：
　　采集24例SLE患者和24例健康人群的血液樣本，從白細胞中提取RNA，用RNA測序（RNA sequencing，RNA-seq）技術(shù)進行轉(zhuǎn)錄組實驗；從全血中提取血漿，用同位素標記相對和絕對定量（isobaric tags for relative and absolute quantitation

7、，iTRAQ）技術(shù)進行蛋白組實驗；從全血中提取血漿，用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）技術(shù)進行代謝組實驗。轉(zhuǎn)錄組和蛋白組實驗需要將樣本混合，具體來說，轉(zhuǎn)錄組實驗中，在SLE患者或者健康人群的組內(nèi)，每8例樣本隨機混合組成1例樣本，由此產(chǎn)生SLE患者和健康人群各3例樣本。蛋白組實驗中，樣本的處理方式與轉(zhuǎn)錄組實驗相同。另外，蛋白組實驗有3次技術(shù)重復(fù)，即樣本重復(fù)上

8、機檢測3次。轉(zhuǎn)錄組實驗中，篩選差異基因mRNA的工具為Noiseq軟件包，標準為差異倍數(shù)≥2、同時偏離概率值≥0.8。蛋白組實驗中，篩選差異蛋白的工具為 Mascot軟件，篩選標準為在3次技術(shù)重復(fù)中至少有2次差異倍數(shù)≥1.200或者≤0.833且P值≤0.05，并且在剩余的重復(fù)中表達趨勢保持一致。代謝組實驗中，篩選差異代謝物的工具為偏最小二乘法辨別分析（partial least-squares discriminant analysi

9、s，PLS-DA）和火山圖，篩選標準為 PLS-DA中變量投影重要性（variable importance in the projection，VIP）≥1并且火山圖中差異倍數(shù)＞1.5或者＜0.67且Q值＜0.05。GO富集分析探索表達差異的分子參與的生物學反應(yīng)，KEGG富集分析探索表達差異的分子參與的信號轉(zhuǎn)導通路。
　　轉(zhuǎn)錄組與蛋白組表達數(shù)據(jù)的關(guān)聯(lián)研究首先將基于參考基因得到的蛋白質(zhì)鑒定數(shù)據(jù)和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行比較，當某一個蛋白質(zhì)在

10、轉(zhuǎn)錄水平上有表達量時，被認為關(guān)聯(lián)到，再將蛋白水平和轉(zhuǎn)錄水平關(guān)聯(lián)到的所有分子的表達數(shù)據(jù)進行 Pearson相關(guān)分析，最后根據(jù)關(guān)聯(lián)到的分子在蛋白水平和轉(zhuǎn)錄水平上的表達趨勢，統(tǒng)計不同類型分子的數(shù)量，一共分成四種情況，分別是：（1）蛋白質(zhì)和基因mRNA水平上變化趨勢相同；（2）蛋白質(zhì)和基因 mRNA水平上變化趨勢相反；（3）基因 mRNA水平有變化而在蛋白質(zhì)水平上無變化；（4）蛋白質(zhì)水平上有變化而在基因mRNA水平上無變化。另外，我們整合轉(zhuǎn)錄組

11、、蛋白組和代謝組KEGG數(shù)據(jù)，尋找SLE發(fā)病機制中關(guān)鍵信號轉(zhuǎn)導通路，明確這條通路上表達水平異常的基因 mRNA、蛋白組和代謝物，同時，將這些數(shù)據(jù)映射到一個KEGG圖上,得出這條通路上的基因mRNA、蛋白質(zhì)和代謝物之間的關(guān)系。
　　結(jié)果：
　　（1）轉(zhuǎn)錄組實驗結(jié)果表明，與健康人群相比，SLE患者中420個基因mRNA表達異常，其中190個上調(diào)，230個下調(diào)。GO富集分析顯示這些基因mRNA主要參與淋巴細胞活化、防御反應(yīng)和白細胞

12、分化等生物學反應(yīng)。KEGG富集分析顯示這些基因mRNA主要參與T細胞受體通路、核因子-kB通路和凝血與補體通路等信號轉(zhuǎn)導通路；（2）蛋白組實驗結(jié)果表明，與健康人群相比，SLE患者中111個蛋白質(zhì)表達異常，其中87個上調(diào)，24個下調(diào)。GO富集分析顯示這些蛋白質(zhì)主要參與炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)等生物學反應(yīng)。KEGG富集分析顯示這些蛋白質(zhì)主要參與凝血與補體信號轉(zhuǎn)導通路；
　　（3）代謝組實驗結(jié)果表明，與健康人群相比，SLE患者中195個代

13、謝物表達異常。KEGG分析顯示這些代謝物主要參與激素生物學合成通路、色氨酸代謝通路和凝血與補體通路等信號轉(zhuǎn)導通路；
　　（4）生物分子的表達量在蛋白水平和轉(zhuǎn)錄水平上的相關(guān)性并不高（r=0.174）。將所有在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平能關(guān)聯(lián)到的分子按“方法”部分的描述分成4組，第一組有5個分子，第二組有4個分子，第三組有15個分子，第四組有0個分子；
　　（5）整合轉(zhuǎn)錄組、蛋白組和代謝組 KEGG數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)凝血與補體通路上多個基因mR

14、NA、蛋白組和代謝物表達異常。同時，將這些數(shù)據(jù)映射到一個 KEGG圖上,得出凝血與補體通路上的基因mRNA、蛋白質(zhì)和代謝物之間的關(guān)系。
　　結(jié)論：
　　SLE患者中多個基因mRNA、蛋白質(zhì)和代謝物表達異常，這些分子參與了多種生物學反應(yīng)和信號轉(zhuǎn)導通路。SLE患者中，生物分子的表達量在蛋白水平和轉(zhuǎn)錄水平上相關(guān)性并不高。凝血與補體通路對SLE發(fā)病機制非常重要。
　　研究二：凝血與補體通路和SLE患者疾病活動度的相關(guān)性研究

15、r>　　目的：
　　研究SLE患者中，凝血與補體通路和疾病活動度的關(guān)聯(lián)，并探討它們的關(guān)聯(lián)是否受到炎癥反應(yīng)影響。
　　方法：
　　酶聯(lián)免疫吸附檢測法（enzyme-linked immunoabsorbent assay，ELISA）測量10個凝血因子、7個補體因子和3個炎癥分子在SLE患者中表達量。凝血因子包括因子7（factor7，F(xiàn)7）、因子9（factor9，F(xiàn)9）、因子12（factor12，F(xiàn)12）、因子13

16、（factor13，F(xiàn)13）、纖維蛋白原（fibrinogen，F(xiàn)IB）、凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物（thrombin-antithrombin complex，TAT）、血管假性血友病因子（Von Willebrand factor，VWF）、蛋白 S（protein S,PS）、D-二聚體(D-dimer)和抗凝血酶3（antithrombin-III，ATIII）。補體因子包括補體3激活劑（complement3 activator，

17、C3a）、補體4激活劑（complement4 activator，C4a）、補體5激活劑（complement5 activator，C5a）、結(jié)合甘露糖的凝集素相關(guān)絲氨酸蛋白酶2（mannose-binding lectin-associated serine proteinase2，MASP2）、補體1q（complement1q，C1q）、補體7（complement7，C7）和因子I（factor I，F(xiàn)I）。炎癥分子包括白介

18、素6（interleukin-6，IL-6）、白介素8（interleukin-8，IL-8），腫瘤壞死因子受體II（tumor necrosis factor-receptor II，TNF-RII）。濁度法定量測定補體4（complement4，C4）在SLE患者中表達量。SLE患者的臨床和實驗室數(shù)據(jù)來自病歷資料。樣本量為112例。
　　根據(jù)研究一的蛋白組和以往的研究結(jié)果，將上述凝血因子、補體因子和炎癥分子共21個指標分成兩部

19、分，即通路激活劑和通路抑制劑。通路激活劑在SLE患者中表達量上升并且表達量與其對應(yīng)通路的活化程度正相關(guān)；通路抑制劑在 SLE患者中表達量下降并且表達量與其對應(yīng)通路的活化程度負相關(guān)。根據(jù)這些標準，凝血因子VWF、F7、TAT、FIB、F9和D-dimer，補體因子C3a、C4a、C5a、MASP2和C7以及炎癥分子TNF-RII、IL-6和IL-8定義為它們各自通路的激活劑；凝血因子PS、F12、F13和ATIII以及補體因子C1q、FI

20、和C4定義為它們各自通路的抑制劑。在通路得分的計算中，激活劑作為正數(shù)而抑制劑作為負數(shù)。計算補體通路得分的指標包括C3a、C4a、C5a、MASP2、C7、C1q、FI和C4。具體計算步驟：（1）以每個指標為單位，將濃度值進行正態(tài)分布檢驗；（2）成非正態(tài)分布的指標進行 log轉(zhuǎn)化；（3）將每個指標中的最大值選出，然后將其他值除以最大值；（4）將每個患者中，補體通路的所有指標得出的數(shù)值相加，計算出的數(shù)值是這個患者補體通路得分。凝血通路得分和

21、炎癥反應(yīng)得分與補體通路得分計算步驟一致。凝血通路得分的指標包括VWF、F7、TAT、FIB、F9、D-dimer、PS、F12、F13和ATIII。炎癥反應(yīng)得分的指標包括TNF-RII、IL-6和IL-8。
　　對凝血通路得分、補體通路得分、炎癥反應(yīng)得分和 SLE疾病活動指數(shù)（SLE disease activity index, SLEDAI）進行柯爾莫哥洛夫-斯摩洛夫（kolmogorov-smirnov，K-S）正態(tài)分布檢驗

22、，非正態(tài)分布的變量進行l(wèi)og轉(zhuǎn)化。Pearson相關(guān)分析檢驗兩個變量的相關(guān)性。多變量線性回歸分析檢驗因變量和自變量的關(guān)系以及自變量間的交互作用。在方差齊性的情況下，用最小二乘差異（least squares difference，LSD）方法檢測變量在不同組別中的差異，在方差不齊的情況下，用事后檢驗[Tamhane’s T2(M)]方法檢測變量在不同組別中的差異。采用SPSS13.00軟件進行統(tǒng)計分析，檢驗水準a=0.05。
　　

23、結(jié)果：
　?。?）凝血通路得分和補體通路得分沒有相關(guān)性（r=0.151,P=0.112）；
　?。?）凝血通路得分、補體通路得分與log轉(zhuǎn)化SLEDAI（log-transformed SLEDAI，ltSLEDAI）的多變量線性回歸分析發(fā)現(xiàn)（A）凝血通路得分和補體通路得分都與ltSLEDAI正相關(guān)(凝血通路得分：β=0.706,95%CI0.371-1.040,P＜0.001，補體通路得分：β=0.590,95%CI0.3

24、28-0.852,P＜0.001)；（B）凝血通路得分和補體通路得分對 ltSLEDAI的影響有交互作用（P＜0.001)，具體表現(xiàn)為在補體通路得分低的SLE患者中，凝血通路得分和ltSLEDAI的聯(lián)系較弱，即在補體通路得分低的SLE患者中，ltSLEDAI在凝血通路得分低的SLE患者和凝血通路得分高的SLE患者之間的差值只有0.334，而這個差值在補體通路得分高的 SLE患者中上漲到0.831。類似的，在凝血通路得分低的 SLE患者中

25、，補體通路得分和 ltSLEDAI的聯(lián)系較弱，即在凝血通路得分低的SLE患者中，ltSLEDAI在補體通路得分低的SLE患者和補體通路得分高的SLE患者之間的差值只有0.436，而這個差值在凝血通路得分高的SLE患者中上漲到0.933；
　　（3）為了檢驗補體通路、凝血通路對 ltSLEDAI的交互作用是否受到炎癥反應(yīng)的影響，將炎癥反應(yīng)得分按其中位數(shù)分成兩組。在炎癥反應(yīng)得分高的 SLE患者中，凝血通路得分和補體通路得分都與 ltS

26、LEDAI正相關(guān)(凝血通路得分：β=1.047,95%CI0.602-1.491, P＜0.001，補體通路得分：β=0.437,95%CI0.130-0.744, P=0.006)；交互作用結(jié)果表明凝血通路得分和補體通路得分對ltSLEDAI的影響有交互作用（P＜0.001)，具體表現(xiàn)為在補體通路得分低的SLE患者中，凝血通路得分和ltSLEDAI的聯(lián)系較弱，即在補體通路得分低的SLE患者中，ltSLEDAI在凝血通路得分低的SLE患

27、者和凝血通路得分高的SLE患者之間的差值只有0.391，而這個差值在補體通路得分高的SLE患者中上漲到0.897。類似的，在凝血通路得分低的SLE患者中，補體通路得分和ltSLEDAI的聯(lián)系較弱，即在凝血通路得分低的SLE患者中，ltSLEDAI在補體通路得分低的SLE患者和補體通路得分高的SLE患者之間的差值只有0.359，而這個差值在凝血通路得分高的SLE患者中上漲到0.805。在炎癥反應(yīng)得分低的 SLE患者中，交互作用結(jié)果表明凝血