miR-31在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者中的表達(dá)及功能初探.pdf

1、目的：微小RNA（miRNA）作為基因表達(dá)調(diào)控的重要分子，在系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用。本研究旨在探索SLE 患者外周血中miR-31 的表達(dá)及其臨床意義，深入研究miR-31 的功能及其在SLE 發(fā)病過程中的作用機制。
　　 方法：1. 應(yīng)用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（Real-time quantitativePCR，RT-PCR）技術(shù)Taqman 探針方法檢測miR-31 在SLE 和正常對照組中外周血的

2、表達(dá)，并進(jìn)行臨床相關(guān)性分析。
　　 2. Taqman RT-PCR 檢測miR-31 在SLE 和正常對照組中CD3+ T 細(xì)胞的表達(dá)；檢測T 細(xì)胞活化過程中miR-31 的表達(dá)變化。分別將miR-31 模擬物和阻遏物及其相關(guān)對照轉(zhuǎn)染原代T 淋巴細(xì)胞， SYBR Green RT-PCR方法檢測IL-2 的mRNA 表達(dá)差異，ELISA（酶聯(lián)免疫吸附實驗）檢測細(xì)胞因子IL-2 的表達(dá)差異。
　　 3. 將 IL-2 啟

3、動子序列克隆到PGL3-Basic 載體中，將含有IL-2 的啟動子序列的載體分別與miR-31 模擬物及其相關(guān)對照共轉(zhuǎn)染Jurkat 細(xì)胞，測定熒光活性，檢測miR-31 對IL-2 的啟動子活性的影響。
　　 4. 運用多個生物信息學(xué)軟件預(yù)測miR-31 的靶基因，SYBR GreenRT-PCR 及免疫蛋白印跡方法檢測miR-31 對潛在靶基因RhoA 的作用。
　　 應(yīng)用RNA 沉默技術(shù)siRNA 沉默靶基因Rh

4、oA，將含有IL-2 的啟動子序列的載體分別與siRNA RhoA 及其相關(guān)對照共轉(zhuǎn)染Jurkat 細(xì)胞，測定熒光活性，檢測siRNA RhoA 對IL-2 啟動子活性的影響。將siRNA RhoA及其相關(guān)對照轉(zhuǎn)染原代T 淋巴細(xì)胞，測定其對IL-2 產(chǎn)生的影響。
　　 5.狼瘡患者T 細(xì)胞和正常對照組T 細(xì)胞激活后，檢測miR-31、RhoA及IL-2 的表達(dá)差異；在狼瘡T 細(xì)胞中分別過表達(dá)miR-31，siRNA RhoA及其

5、相關(guān)對照，檢測IL-2 的表達(dá)變化。
　　 結(jié)果：1. SLE患者外周血細(xì)胞miR-31 表達(dá)水平顯著低于正常對照組；SLE 患者中miR-31 表達(dá)水平與SLEDAI 積分、Renal-SLEDAI 積分負(fù)相關(guān)性，與臨床用藥情況無相關(guān)性。
　　 2. SLE 患者CD3+T 細(xì)胞中miR-31 表達(dá)水平顯著低于正常對照組；miR-31 參與T 細(xì)胞的活化，促進(jìn)細(xì)胞因子IL-2 的產(chǎn)生。
　　 3. miR-31

6、 增強IL-2 啟動子的活性，并呈濃度依賴性。 miR-31 抑制靶基因RhoA 的mRNA 水平及蛋白水平，siRNA RhoA 增強IL-2 啟動子的活性，促進(jìn)細(xì)胞因子IL-2 的產(chǎn)生。
　　 4. SLE 患者CD3+T 細(xì)胞中RhoA 表達(dá)水平顯著高于正常對照組，與miR-31 表達(dá)水平負(fù)相關(guān)性。SLE 患者T 細(xì)胞激活后，miR-31 及細(xì)胞因子IL-2 顯著低于正常對照組，RhoA 的表達(dá)水平顯著高于正常對照組。細(xì)胞

7、轉(zhuǎn)染證實miR-31 及siRNA RhoA 促進(jìn)狼瘡T 細(xì)胞IL-2 的產(chǎn)生，表明miR-31 通過抑制RhoA 的表達(dá)，促進(jìn)狼瘡T 細(xì)胞IL-2 的產(chǎn)生。
　　 結(jié)論：
　　 1. SLE 患者外周血miR-31 表達(dá)水平與疾病活動及腎臟損害負(fù)相關(guān)，作為重要生物標(biāo)志物有可能為SLE 的早期診斷及預(yù)后評估提供一定依據(jù)。
　　 2.在狼瘡患者T 細(xì)胞中缺陷表達(dá)的miR-31，可通過作用于靶基因RhoA 增強IL-