喹噁啉類藥物對產(chǎn)氣莢膜梭菌和豬痢疾短螺旋體的抗菌作用機理.pdf

1、喹噁啉類化合物具有多種生物功能，被廣泛運用于畜禽業(yè)，主要包括卡巴氧、喹乙醇（OLA）、乙酰甲喹、喹烯酮和喹賽多（CYA）。喹噁啉類藥物對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均有效，尤其是在厭氧條件下抗菌效果特別好。盡管喹噁啉類藥物具有比較好的抗菌作用，但是它們的抗菌作用機制并不是很清楚。之前的研究表明，喹噁啉類藥物是通過損傷DNA來發(fā)揮抗菌作用的，但是，喹噁啉類藥物是怎樣損傷DNA的并不清楚，而且研究對象幾乎都是大腸桿菌。為了更好的闡明喹噁啉類藥

2、物的抗菌作用機理，本次實驗選取對喹噁啉類藥物都比較敏感的兩株厭氧菌作為實驗菌種：一株是革蘭氏陽性菌產(chǎn)氣莢膜梭菌，一株是革蘭氏陰性菌豬痢疾短螺旋體，并選取喹賽多和喹乙醇作為喹噁啉類藥物的代表藥物進行研究。在厭氧條件下，通過高效液相色譜儀(HPLC)分析喹賽多和喹乙醇在兩種細菌中的脫氧代謝物的種類并檢測脫氧代謝物的抗菌活性；研究喹賽多和喹乙醇對起兩株細菌的形態(tài)影響，對細菌的細胞膜、細胞壁的和染色體DNA的完整性的影響；通過熒光探針探針檢測經(jīng)

3、過喹噁啉類藥物作用后細菌體內(nèi)的活性氧自由基。本實驗的研究能夠更好的闡述喹噁啉類藥物在厭氧條件下的抗菌作用機理，是對喹噁啉類藥物抗菌作用機制的驗證和補充，有助于喹噁啉類新藥物的研發(fā)，并為喹噁啉類新藥物的臨床應(yīng)用提供更加可靠的科學(xué)依據(jù)。
　　1喹噁啉類藥物在兩株菌體內(nèi)的脫氧代謝物種類及其代謝物的抗菌活性
　　在厭氧條件下，藥敏試驗結(jié)果表明喹賽多對產(chǎn)氣莢膜梭菌和豬痢疾短螺旋體的MIC值分別為1、0.031μg/mL，喹乙醇對產(chǎn)氣莢

4、膜梭菌和豬痢疾短螺旋體的MIC值分別為1、0.0625μg/mL，這說明喹賽多和喹乙醇對產(chǎn)氣莢膜梭菌和豬痢疾短螺旋體都很敏感。
　　通過HPLC分別在產(chǎn)氣莢膜梭菌CVCC1125和豬痢疾短螺旋體B204與喹賽多孵育的上清液中檢測到喹賽多的兩種脫氧代謝物（Cy1，脫二氧喹賽多；Cy2， N4脫一氧喹賽多），但是均沒有檢測到N1脫一氧喹賽多（Cy2）。用同樣的方法分別在產(chǎn)氣莢膜梭菌和豬痢疾短螺旋體與喹乙醇孵育的培養(yǎng)基上清液中檢測到喹乙

5、醇的兩種脫氧代謝物（O1，N1脫一氧喹乙醇；O2，脫二氧喹乙醇），但是沒有檢測到N4脫一氧喹乙醇（O7）。藥敏試驗結(jié)果表明喹賽多和喹乙醇的脫氧代謝物對產(chǎn)氣莢膜梭菌和豬痢疾短螺旋體均沒有抗菌活性，這說明喹噁啉類藥物確實是在脫氧過程中發(fā)揮抗菌作用。
　　2.喹噁啉類藥物對產(chǎn)氣莢膜梭菌和豬痢疾短螺旋體的形態(tài)變化的影響
　　在本實驗中，通過光學(xué)顯微鏡發(fā)現(xiàn)亞抑菌濃度（1/2 MIC）喹賽多和喹乙醇處理組的產(chǎn)氣莢膜梭菌和豬痢疾短螺旋體的

6、菌體都較空白組的菌體變長，呈纖維絲狀，這種現(xiàn)象可能是細菌 DNA受損后的出現(xiàn)的應(yīng)激反應(yīng)。掃描電鏡（SEM）圖表明：喹噁啉類藥物作用于產(chǎn)氣莢膜梭菌后，細菌變長，表面還變得粗糙，甚至出現(xiàn)了斷裂；豬痢疾短螺旋體經(jīng)喹噁啉類藥物處理后，菌體出現(xiàn)聚集，卷曲現(xiàn)象，有些菌體甚至出現(xiàn)畸形。透射電鏡（TEM）圖表明：喹噁啉類藥物作用于產(chǎn)氣莢膜梭菌后，菌體出現(xiàn)了不均等分裂現(xiàn)象，細胞質(zhì)變得稀疏。豬痢疾短螺旋體經(jīng)喹噁啉類藥物處理后，細胞質(zhì)泄露很嚴重。
　　

7、3.喹噁啉類藥物對兩株菌的細胞壁和細胞膜的完整性影響
　　在本研究中，經(jīng)過喹噁啉類藥物處理的產(chǎn)氣莢膜梭菌和豬痢疾短螺旋體的培養(yǎng)液上清中的堿性磷酸酶的水平與空白組相比較有所增加，而且產(chǎn)氣莢膜梭菌上清液中的堿性磷酸酶水平比豬痢疾短螺旋體的上清液中堿性磷酸酶水平更高，這是可能是因為產(chǎn)氣莢膜梭菌在遇到氧化應(yīng)激后會產(chǎn)生孢子，在這個過程中，堿性磷酸酶的合成量會有所增加。
　　通過測定細胞內(nèi)的泄漏物質(zhì)在260 nm的吸光度來反映細胞膜的完

8、整性是否遭到破壞。OD260的升高象征著細胞質(zhì)中核酸的泄露，因此能夠反映細胞膜是否收到損傷。結(jié)果表明，經(jīng)過藥物處理后，細菌上清液在260 nm處的吸光度隨時間在增加，而且藥物濃度越高，OD260的升高依賴于藥物的濃度和孵育的時間。
　　4.產(chǎn)氣莢膜梭菌和豬痢疾短螺旋體內(nèi)的自由基
　　在厭氧條件下，MIC和4 MIC的喹賽多作用于產(chǎn)氣莢膜梭菌和豬痢疾短螺旋體后體內(nèi)有活性氧自由基（ROS）產(chǎn)生。藥物濃度越高，ROS水平越高。然而

9、不同濃度的喹噁啉作用于產(chǎn)氣莢膜梭菌后，ROS水平在90～120 min有所下降，與此相反，豬痢疾短螺旋體體內(nèi)的ROS水平在30 min～120 min內(nèi)處于累計狀態(tài)，這可能是由于產(chǎn)氣莢膜梭菌體內(nèi)的超氧化物氣化酶（SOD）和過氧化氫酶的清除活力更強引起的。
　　根據(jù)以前的報道，喹噁啉類藥物在體內(nèi)是通過酶的作用下產(chǎn)生自由基中間體從而對DNA造成損傷。厭氧條件下，這種自由基中間體可能通過化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生羥基自由基。在本實驗中，MIC和4 M

10、IC的喹賽多作用于產(chǎn)氣莢膜梭菌后菌體內(nèi)都有羥基自由基產(chǎn)生，羥基自由基會損傷細胞膜，DNA以及內(nèi)部的呼吸系統(tǒng)，最終引起細胞壁損傷。
　　5.喹噁啉類藥物誘導(dǎo)的兩株菌的染色體DNA損傷
　　8-羥基脫氧鳥苷酸（8-OHdG）水平是DNA遭到氧化性損傷程度的標(biāo)志物，本實驗中，喹噁啉類藥物作用后的產(chǎn)氣莢膜梭菌和豬痢疾短螺旋體內(nèi)的8-OHdG水平跟空白組相比較，明顯升高，說明藥物作用后這兩株菌體內(nèi)的染色體 DNA受到了氧化性損傷。而8

11、-OHdG的形成又會導(dǎo)致DNA的斷裂，染色體DNA斷裂可以通過瓊脂糖凝膠顯示。瓊脂糖凝膠電泳圖顯示經(jīng)過藥物處理后的兩株菌的DNA均有拖尾和彌散現(xiàn)象，這說明染色體DNA出現(xiàn)了降解和斷裂。除此之外，豬痢疾短螺旋體的基因組中發(fā)現(xiàn)了片段大小為6～8kb的條帶，根據(jù)文獻報道，這可能是豬痢疾短螺旋體內(nèi)被誘導(dǎo)的前噬菌體VSH-1。
　　總之，在厭氧條件下，喹噁啉類藥物是具有厭氧選擇活性的還原性DNA損傷劑，通過藥物代謝過程中產(chǎn)生的ROS和羥基自

12、由基不僅僅可以造成DNA的氧化性損傷而且還會造成細胞壁和細胞膜的損傷，從而最終導(dǎo)致細菌死亡。本實驗驗證了喹噁啉類藥物在無氧環(huán)境更有利于喹噁啉類藥物代謝過程中自由基的有效產(chǎn)生，而且喹噁啉藥物對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的抗拒能作用機制是相似的。
　　而不同濃度的喹噁啉作用于產(chǎn)氣莢膜梭菌后，ROS水平在90～120 min有所下降，與此相反，豬痢疾短螺旋體體內(nèi)的ROS水平在30 min～120 min內(nèi)處于累計狀態(tài)，這可能是由于產(chǎn)氣莢

13、膜梭菌體內(nèi)的超氧化物氣化酶（SOD）和過氧化氫酶的清除活力更強引起的。
　　根據(jù)以前的報道，喹噁啉類藥物在體內(nèi)是通過酶的作用下產(chǎn)生自由基中間體從而對DNA造成損傷。厭氧條件下，這種自由基中間體可能通過化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生羥基自由基。在本實驗中，MIC和4 MIC的喹賽多作用于產(chǎn)氣莢膜梭菌后菌體內(nèi)都有羥基自由基產(chǎn)生，羥基自由基會損傷細胞膜，DNA以及內(nèi)部的呼吸系統(tǒng)，最終引起細胞壁損傷。
　　5.喹噁啉類藥物誘導(dǎo)的兩株菌的染色體DNA損

14、傷
　　8-羥基脫氧鳥苷酸（8-OHdG）水平是DNA遭到氧化性損傷程度的標(biāo)志物，本實驗中，喹噁啉類藥物作用后的產(chǎn)氣莢膜梭菌和豬痢疾短螺旋體內(nèi)的8-OHdG水平跟空白組相比較，明顯升高，說明藥物作用后這兩株菌體內(nèi)的染色體 DNA受到了氧化性損傷。而8-OHdG的形成又會導(dǎo)致DNA的斷裂，染色體DNA斷裂可以通過瓊脂糖凝膠顯示。瓊脂糖凝膠電泳圖顯示經(jīng)過藥物處理后的兩株菌的DNA均有拖尾和彌散現(xiàn)象，這說明染色體DNA出現(xiàn)了降解和斷裂。

15、除此之外，豬痢疾短螺旋體的基因組中發(fā)現(xiàn)了片段大小為6～8kb的條帶，根據(jù)文獻報道，這可能是豬痢疾短螺旋體內(nèi)被誘導(dǎo)的前噬菌體VSH-1。
　　總之，在厭氧條件下，喹噁啉類藥物是具有厭氧選擇活性的還原性DNA損傷劑，通過藥物代謝過程中產(chǎn)生的ROS和羥基自由基不僅僅可以造成DNA的氧化性損傷而且還會造成細胞壁和細胞膜的損傷，從而最終導(dǎo)致細菌死亡。本實驗驗證了喹噁啉類藥物在無氧環(huán)境更有利于喹噁啉類藥物代謝過程中自由基的有效產(chǎn)生，而且喹噁啉