產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素抗體捕獲ELISA檢測(cè)方法的建立和初步應(yīng)用.pdf

1、產(chǎn)氣莢膜梭菌（C.perfringens）又名魏氏梭菌，是一種廣泛存在于自然界和動(dòng)物腸道中的細(xì)菌，屬于條件性致病菌。可產(chǎn)生多種外毒素和酶類，主要產(chǎn)生α、β、ε和ι四種毒素，其中α毒素是產(chǎn)氣莢膜梭菌最重要的毒素，各種類型的產(chǎn)氣莢膜梭菌均可產(chǎn)生α毒素。目前,對(duì)畜禽產(chǎn)氣莢膜梭菌感染抗體檢測(cè)方法主要有小鼠中和試驗(yàn)、卵磷脂酶抑制試驗(yàn)等，但因其操作過程復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng),不適于大批量臨床樣品的檢測(cè)。國(guó)外已經(jīng)出現(xiàn)多種檢測(cè)產(chǎn)氣莢膜梭菌疾病的商品檢測(cè)試劑盒,但

2、價(jià)格昂貴。所以為了彌補(bǔ)國(guó)內(nèi)空白急需建立快速、靈敏、特異并能大批量應(yīng)用于檢測(cè)該病的方法。
　　本研究采用實(shí)驗(yàn)室保存的分泌抗產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞F12，通過擴(kuò)大培養(yǎng)、接種小鼠、收集腹水、腹水純化等程序得到α毒素單克隆抗體，并對(duì)其效價(jià)進(jìn)行了測(cè)定。用實(shí)驗(yàn)室保存的產(chǎn)氣莢膜標(biāo)準(zhǔn)菌株NCTC528進(jìn)行復(fù)蘇、增菌、產(chǎn)毒、提純等程序得到外毒素，并對(duì)其濃度進(jìn)行檢測(cè)。選取1.0-1.5 Kg健康未接種過疫苗的家兔5只,利用滅活的α毒

3、素和弗氏完全佐劑按照等體積混合乳化按照設(shè)定免疫程序?qū)彝眠M(jìn)行免疫制備高免血清。
　　上述經(jīng)純化后的單克隆抗體F12作為包被抗體，提純后的外毒素作為捕獲抗原，高免血清作為捕獲ELISA的陽性對(duì)照血清,從而建立了α毒素抗體捕獲ELISA檢測(cè)方法。通過對(duì)各步反應(yīng)條件的優(yōu)化，最終獲得最佳工作條件為:單抗1：6400稀釋即工作濃度為0.33μg/mL,待檢血清1:160稀釋,抗原1：1000即工作濃度為2μg/mL。用建立好的ELISA方法

4、檢測(cè)33份陰性血清,計(jì)算其平均值X=0.243與標(biāo)準(zhǔn)差SD=0.015，求得陽性臨界值為0.288,陰性臨界值為0.273,當(dāng)血清檢測(cè)值C≧0.288(C=X+3SD)時(shí)判定為陽性,C≦0.273(C=X+2SD)時(shí)為陰性，0.288＞C＞0.273時(shí)為可疑。特異性結(jié)果表明：該方法對(duì)大腸桿菌，沙門氏菌、鴨疫里默氏桿菌分別免疫兔子所得血清無特異性交叉反應(yīng)。敏感性實(shí)驗(yàn)表明:本研究制備的兔抗α毒素高免血清,采用本研究建立的捕獲ELIS A方法

5、測(cè)得抗體效價(jià)1：640,經(jīng)典小鼠中和實(shí)驗(yàn)測(cè)得中和抗體效價(jià)為1：400,本研究建立的ELISA方法敏感性較高。重復(fù)性實(shí)驗(yàn)得出批內(nèi)變異系數(shù)為1.21％~6.53%,批間變異系數(shù)為1.78%~7.31%，兩者均小于10%,說明同一樣品在同批和不同批試驗(yàn)中變異程度小,說明該方法具有很好的重復(fù)性。
　　上述結(jié)果說明,已成功建立特異性、敏感性、重復(fù)性好的用于α毒素抗體捕獲ELI SA檢測(cè)方法。該方法為免疫效果的測(cè)定提供了一種新的途徑,為臨床快