產(chǎn)氣莢膜梭菌NetB毒素阻斷ELISA方法的建立與應(yīng)用.pdf

1、產(chǎn)氣莢膜梭菌(CP)是一種重要的人獸共患病病原體，廣泛分布于自然界，可導(dǎo)致多種動物發(fā)生壞死性腸炎、腸毒血癥以及人類的氣性壞疽和食物中毒。迄今為止，已研究發(fā)現(xiàn)該菌能產(chǎn)生15種外毒素。NetB毒素是首次在壞死性腸炎(NE)病雞體內(nèi)分離的A型CP中發(fā)現(xiàn)的，NetB毒素在禽類NE的發(fā)病機(jī)制中是一種關(guān)鍵的致病因子。因此，研究該毒素蛋白的生物學(xué)功能及檢測方法對CP的診斷和防治有重要的意義。
　　本文將CP NetB毒素蛋白表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)切膠純化和

2、復(fù)性后免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗體，應(yīng)用間接ELISA和Western blot方法對所制備的抗體進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示多抗血清效價(jià)達(dá)到1∶32768，且重組蛋白與制備的多克隆抗體發(fā)生特異性結(jié)合，具有良好的反應(yīng)原性。將實(shí)驗(yàn)室保存的4株抗NetB毒素雜交瘤細(xì)胞株復(fù)蘇并進(jìn)行生物學(xué)活性分析，選擇反應(yīng)性好的單克隆抗體(McAb)F9G3株腹腔接種BALB/c小鼠成功進(jìn)行了腹水的制備。
　　以純化的CP重組NetB蛋白、兔抗CP NetB蛋白

3、多抗和F9G3 McAb經(jīng)三因素優(yōu)化建立了檢測CP抗體的阻斷ELISA方法。優(yōu)化后結(jié)果顯示抗原最佳包被濃度為0.5μg/100μL，包被時(shí)間為4℃過夜;最佳封閉液為1％BSA，時(shí)間為37℃作用2h;待檢血清的作用時(shí)間為1.5h;單克隆抗體的最佳工作濃度為0.0625μg/100μL，時(shí)間為37℃作用1 h;酶標(biāo)抗體最佳稀釋度為1∶5000，時(shí)間為37℃孵育1 h;最佳顯色液作用時(shí)間為10 min。通過對90份CP陰性血清阻斷ELISA檢