自發(fā)性2型糖尿病KKAy小鼠腎小球蛋白表達譜及氯沙坦治療效應的研究.pdf

1、目的：糖尿病腎病是引起終末期腎病的主要原因之一，也是糖尿病患者致死的主要合并癥。參與糖尿病腎病發(fā)病的相關因子眾多，針對其中某一因子的研究方式已無法滿足對糖尿病腎病進行全方位研究的要求，迫切需要應用基因組、蛋白質(zhì)組等系統(tǒng)生物學研究思想和方法，以尋找在糖尿病腎病發(fā)病過程中發(fā)揮關鍵作用的基因與蛋白質(zhì)分子，分析其相互作用和交叉對話，從整體水平上探討糖尿病腎病的發(fā)病機制，為糖尿病腎病的診斷、預防和治療提供新思路。
　　 本研究應用雙向差異

2、凝膠電泳及質(zhì)譜法檢測自發(fā)性2型糖尿病KKAy小鼠腎小球蛋白表達譜，并觀察糖尿病腎病發(fā)病過程中腎小球蛋白表達譜的變化及氯沙坦治療對糖尿病腎病發(fā)病過程中腎小球蛋白表達譜的影響。旨在尋找與糖尿病腎病發(fā)病過程密切相關的蛋白質(zhì)，以探明糖尿病腎病及氯沙坦腎臟保護作用的可能機制。
　　 方法：
　　 本研究以雄性自發(fā)性2型糖尿病KKAy小鼠及對照組雄性C57BL/6小鼠為研究對象，KKAy小鼠隨機分為非治療組及氯沙坦治療組，治療組從8

3、周齡始予以氯沙坦原藥粉末[10mg· kg-1·day-1]飲水喂入至20周齡，并根據(jù)小鼠體重及飲水量的變化情況，動態(tài)調(diào)整氯沙坦給藥濃度。分別于8周齡、20周齡測量KKAy小鼠及對照組小鼠體重、血糖、血肌酐及尿素氮、尿白蛋白/肌酐，觀察腎臟病理變化。應用磁珠灌注法分離自發(fā)性2型糖尿病KKAy小鼠及對照組C57BL/6小鼠腎小球，光學及電子顯微鏡下檢測腎小球分離純度及效果，提取腎小球總蛋白，測定腎小球蛋白提取量。應用CyDyes熒光染料最

4、小標記法、雙向差異凝膠電泳及MALDI-TOF質(zhì)譜法分析腎小球蛋白表達譜的變化。應用蛋白質(zhì)印跡法(westernblot)對差異表達蛋白進行驗證。應用免疫組織化學法檢測腎小球IκBα、NF-κBp65的表達情況。同時觀察氯沙坦對糖尿病腎病腎小球蛋白表達譜及腎小球IKBα、NF-κBp65表達情況的影響。
　　 結果：
　　 1、2型糖尿病KKAy小鼠體重和血糖較正常對照組C57BL/6小鼠顯著升高(p＜0.05)，20周

5、齡KKAy小鼠尿白蛋白/肌酐比率明顯增加(p＜0.05)。氯沙坦治療顯著改善KKAy小鼠的白蛋白尿水平和病理損害，而對血糖無影響。
　　 2、磁珠灌注法提取小鼠腎小球，分離純度為96.67±1.16％。20周齡KKAy小鼠及C57BL/6小鼠，平均每只小鼠分別可提取腎小球蛋白261.1±57.61μg和55.8±17.02μg。
　　 3、經(jīng)DeCyder2-D差異分析軟件分析，發(fā)現(xiàn)8周齡KKAy小鼠較8周齡C57BL/

6、6小鼠的腎小球內(nèi)差異蛋白質(zhì)斑點179個，對其進行肽指紋圖分析，鑒定出Phosphoenolpyruvate carboxykinase，Isocitrate dehydrogenase等55種蛋白質(zhì)。20周齡KKAy非治療組小鼠與正常對照組C57BL/6小鼠腎小球內(nèi)差異蛋白質(zhì)斑點114個，對其進行肽指紋圖分析，鑒定出56種蛋白質(zhì)。其中表達上調(diào)的蛋白質(zhì)有46個，包括Catalase，Stress-70 protein，Prohibitin

7、等;表達下調(diào)的蛋白質(zhì)有10個，包括Sorbitol dehydrogenase，Aspartoacylase-2等。20周齡與8周齡KKAy小鼠腎小球內(nèi)差異蛋白質(zhì)斑點190個，對其進行肽指紋圖分析，鑒定出74種蛋白質(zhì)。其中表達下調(diào)的蛋白質(zhì)有73個，包括78 kDa glucose-regulated protein，Heat shockprotein90，14-3-3 protein epsilon等;表達上調(diào)的蛋白質(zhì)有1個，為Homo

8、gentisate1，2-dioxygenase。經(jīng)氯沙坦治療，包括14-3-3 epsilon在內(nèi)的11種蛋白的異常表達被抑制。
　　 4、經(jīng)western blot檢測，Heat shock protein90(HSP90)、磷酸化核因子κB抑制物激酶(p-IKKα/β)、78 kDa glucose-regulated protein(GRP78)于KKAy小鼠腎小球中表達上調(diào)，其中20周齡KKAy小鼠腎小球中HSP90、

9、p-IKKα/β、GRP78的表達水平分別較8周齡KKAy小鼠表達下調(diào)，14-3-3 epsilon蛋白于20周齡KKAy小鼠腎小球中表達上調(diào)，于20周齡KKAy小鼠氯沙坦治療組腎小球中表達下調(diào)。
　　 5、經(jīng)免疫組織化學法檢測，IκBα于KKAy小鼠腎小球中表達減少，NF-κBp65于KKAy小鼠腎小球細胞核中表達增多，以20周齡KKAy小鼠非治療組最為明顯。氯沙坦治療使20周齡KKAy小鼠腎小球中IκBα表達增多，NF-κB

10、p65于腎小球細胞核中表達減少。
　　 結論：
　　 1、20周齡KKAy小鼠出現(xiàn)肥胖、高血糖、尿白蛋白排泄率增加及典型的糖尿病腎病早期病理改變，氯沙坦治療能降低自發(fā)性2型糖尿病KKAy小鼠尿白蛋白排泄率，改善腎臟病理損害。
　　 2、本實驗成功獲得了自發(fā)性2型糖尿病KKAy小鼠腎小球蛋白表達譜。鑒定出8周齡KKAy小鼠與正常對照C57BL/6小鼠腎小球內(nèi)差異表達蛋白55個，20周齡與8周齡KKAy小鼠腎小球內(nèi)差

11、異表達蛋白74個，20周齡KKAy小鼠較正常對照C57BL/6小鼠腎小球內(nèi)表達上調(diào)蛋白46個，表達下調(diào)蛋白10個。氯沙坦治療抑制了14-3-3 epsilon等11種蛋白質(zhì)在糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展過程中的異常表達。
　　 3、糖尿病階段，KKAy小鼠腎小球中熱休克蛋白90(heat shock protein90)、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(78 kDa glucose-regulated protein)表達上調(diào)，NF-KB激活，隨著糖