化痰中藥陳皮對(duì)光老化皮膚的作用研究.pdf

1、背景：皮膚作為人體外在淺表的器官，從皮膚的衰老狀態(tài)能夠體現(xiàn)出整個(gè)機(jī)體的衰老狀態(tài)，同時(shí)也是判斷人體衰老程度的最直觀的參考指標(biāo)。而皮膚光老化是日常中最容易發(fā)生，同時(shí)也是最需要預(yù)防和治療的。皮膚光老化是指日光中的紫外線長(zhǎng)期輻射損害并長(zhǎng)期積累導(dǎo)致皮膚衰老的過(guò)程。紫外線輻射會(huì)使皮膚變得粗糙、失去光澤，產(chǎn)生皺紋，長(zhǎng)期積累會(huì)發(fā)生真皮炎癥反應(yīng)，激活血管周?chē)木奘杉?xì)胞、肥大細(xì)胞，細(xì)胞因子及炎性遞質(zhì)可導(dǎo)致組織溶解酶如膠原酶、彈性蛋白酶等的釋放，從而緩慢地溶

2、解真皮中的成分，更嚴(yán)重的會(huì)導(dǎo)致皮膚發(fā)生病變?nèi)缙つw癌。長(zhǎng)期的紫外線照射會(huì)使皮膚過(guò)早的發(fā)生老化，從而疊加形成實(shí)質(zhì)性的老化。但是并非所有的光老化是相等的，該過(guò)程受到皮膚類(lèi)型和種族的影響，同時(shí)光老化的程度還取決于地理位置、從事的職業(yè)、生活方式及采用的保護(hù)措施（包括使用防曬霜及遮陽(yáng)衣等）等。普遍來(lái)說(shuō)，人們受到社會(huì)、文化及個(gè)人價(jià)值觀的影響，非常注重關(guān)心自己的外觀，雖然每個(gè)人的審美觀不同，但是擁有青春的外表是一個(gè)永恒的標(biāo)準(zhǔn)。而光老化的程度在判斷是否保

3、留青春中扮演著重要的作用。因此，在世界各地如何延緩皮膚老化已成為一個(gè)重要的科學(xué)問(wèn)題。根據(jù)中醫(yī)基礎(chǔ)理論，痰形成后，內(nèi)而臟腑，外達(dá)皮肉筋骨，使臟腑失養(yǎng)，生理功能衰退，代謝失常，進(jìn)而加快衰老進(jìn)程，因此化痰已成為延緩皮膚衰老的重要制法之一。目前，探討延緩皮膚光老化藥物多從抗氧化方面進(jìn)行，較少提及其他方面，本文將從非酶糖基化反應(yīng)及分子水平探討化痰類(lèi)代表中藥陳皮的提取物對(duì)皮膚光老化的作用。
　　目的：⑴觀察陳皮提取物對(duì)皮膚光老化裸鼠背部皮膚組

4、織病理學(xué)及羥脯氨酸(Hyp)、醛糖還原酶(AR)含量、非酶糖基化終端產(chǎn)物(AGEs)的影響;⑵觀察陳皮提取物對(duì)皮膚光老化裸鼠背部皮膚P16蛋白表達(dá)的影響;⑶觀察陳皮提取物經(jīng)皮透過(guò)液對(duì)光老化皮膚成纖維細(xì)胞存活率及β-半乳糖苷酶表達(dá)的影響;⑷觀察陳皮提取物經(jīng)皮透過(guò)液對(duì)光老化皮膚成纖維細(xì)胞周期及凋亡的影響。
　　方法：①SPF級(jí)雌性balb/c裸鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、維生素E組(5g/g)及陳皮提取物高(1g/g)、低劑量組(0.5

5、g/g)五組。采用UVA、UVB紫外照射燈建立裸鼠皮膚光老化模型。連續(xù)8周，給藥組于造模同時(shí)給予裸鼠背部涂布給藥，8周末，取背部皮膚，在光學(xué)顯微鏡下觀察各組裸鼠背部皮膚的病理組織結(jié)構(gòu)（HE染色、Masson染色、醛品紅染色）;比色法檢測(cè)背部皮膚組織羥脯氨酸(Hyp)的含量;Elisa法測(cè)定背部皮膚非酶糖基化終產(chǎn)物(AGEs)及醛糖還原酶(AR)的活性;Western Blot法檢測(cè)背部皮膚P16蛋白的表達(dá)。②采用貼塊法提取SPF級(jí)SD乳

6、大鼠背部皮膚成纖維細(xì)胞，取第4-7代皮膚成纖維細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分為正常組、模型組、維生素E組(0.01g/ml)、維生素E組(0.05g/mL)及陳皮提取物經(jīng)皮透過(guò)液高(100mg/mL)、中(50mg/mL)、低劑量組(25mg/mL)七組。采用MTT法測(cè)定皮膚成纖維細(xì)胞存活率;β-半乳糖苷酶染色法觀察皮膚成纖維細(xì)胞衰老情況;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)皮膚成纖維細(xì)胞周期變化及凋亡情況。
　　結(jié)果：⑴裸鼠一般行為學(xué)、背部皮膚組織病理學(xué)結(jié)構(gòu)的改變

7、正常組裸鼠皮膚表面細(xì)膩光澤無(wú)皺紋，皮膚薄且滋潤(rùn)有彈性;模型組裸鼠體型瘦小，皮膚明顯增厚，膚色暗淡光澤度差，有明顯的粗深皺紋，表現(xiàn)為典型的皮膚光老化現(xiàn)象;維生素E組和陳皮高、低劑量組裸鼠皮膚均有不同程度的增厚、光澤度欠缺、皺紋產(chǎn)生及損傷紅腫等，但均較模型組有所改善。光鏡顯示:裸鼠背部皮膚病理組織切片染色結(jié)果可見(jiàn)正常組裸鼠皮膚組織結(jié)構(gòu)完整，厚度正常，表皮層與真皮層分界清楚，真皮層可見(jiàn)波浪狀膠原纖維組織，呈天藍(lán)色且染色較深，分布均勻，排列規(guī)則

8、有序且緊密有致，彈性纖維輪廓清晰，交織成網(wǎng)狀，形態(tài)細(xì)長(zhǎng)而規(guī)則;模型組裸鼠可見(jiàn)表皮角化過(guò)度明顯，表皮明顯增厚，分層不清，腺體明顯減少，真皮層細(xì)胞減少且排列混亂，血管擴(kuò)張明顯，部分充血，有明顯的淋巴細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，膠原纖維染色不均且顏色淺，疏散、部分增粗或結(jié)合呈團(tuán)塊、排列不規(guī)則，彈性纖維數(shù)量減少，大部分成斷裂狀且無(wú)輪廓邊界，粗短扭曲，部分濃染;陳皮高、低劑量組均改善了光老化裸鼠皮膚的病理組織結(jié)構(gòu)，其中高劑量組效果為佳。⑵模型組裸鼠背

9、部皮膚Hyp較正常組表達(dá)減少(P＜0.05)，AGEs較正常組表達(dá)增加(P＜0.05)，AR較正常組表達(dá)無(wú)明顯差別，P16蛋白表達(dá)較正常組表達(dá)增強(qiáng)(P＜0.05)，而陳皮提取物可以顯著提高Hyp含量(P＜0.05)且有減少AGEs活性的趨勢(shì)(P＜0.05)、降低P16蛋白的表達(dá)(P＜0.05)，但對(duì)AR的表達(dá)均無(wú)明顯影響。⑶正常組皮膚成纖維細(xì)胞存活率高，細(xì)胞間排列緊密，細(xì)胞形態(tài)呈細(xì)長(zhǎng)纖維形;而模型組經(jīng)紫外線照射后，存活率明顯降低(P＜0

10、.05)，出現(xiàn)萎縮、變圓，胞漿中可見(jiàn)黑色小點(diǎn)，懸浮細(xì)胞增多;維生素E組及陳皮高、中、低劑量組懸浮及萎縮皮膚成纖維細(xì)胞都有不同程度的減少，且大部分細(xì)胞形態(tài)飽滿呈梭形，其中以陳皮高劑量組效果最優(yōu)。⑷正常組皮膚成纖維細(xì)胞凋亡率為4.91％，而皮膚成纖維細(xì)胞經(jīng)紫外線照射后凋亡率為44.97％，細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯增加，經(jīng)不同藥物不同濃度處理后，可見(jiàn)細(xì)胞凋亡率均有不同程度的下降，其中以100mg/ml陳皮經(jīng)皮透過(guò)液效果最優(yōu);各組皮膚成纖維細(xì)胞SubG

11、1期細(xì)胞有減少的趨勢(shì)。
　　結(jié)論：①動(dòng)物模型病變特點(diǎn):模型組裸鼠在行為學(xué)上表現(xiàn)出明顯的皮膚光老化癥狀:外觀上皮膚出現(xiàn)明顯的深粗皺紋，光澤度減少;病理組織學(xué)上皮膚表皮明顯增厚，真皮層中成纖維細(xì)胞減少，膠原纖維疏散，彈性纖維斷裂或聚集，表明裸鼠皮膚光老化模型復(fù)制成功。而陳皮提取物能有效地改善皮膚光老化癥狀、減少粗深皺紋的產(chǎn)生、通過(guò)對(duì)膠原纖維及彈性纖維的保護(hù)，增加羥脯氨酸在皮膚中的含量，減少非酶糖基化終端產(chǎn)物及衰老相關(guān)蛋白P16的表達(dá)，

12、同時(shí)減少真皮成纖維細(xì)胞因紫外線照射的凋亡，從而達(dá)到抵抗皮膚光老化的作用。②非酶糖基化特征:非酶糖基化對(duì)皮膚衰老的影響主要是通過(guò)對(duì)膠原纖維和彈性纖維作用而實(shí)現(xiàn)。隨著非酶糖基化終端產(chǎn)物的增加，可以下調(diào)膠原纖維的合成和促進(jìn)其降解，而羥脯氨酸是真皮內(nèi)含量豐富而且比較穩(wěn)定的氨基酸，真皮層中膠原纖維的含量變化可以通過(guò)羥脯氨酸的含量多少直接的反應(yīng)出來(lái);與此同時(shí)彈性纖維中的彈性蛋白與細(xì)胞外液中的葡萄糖發(fā)生非酶糖基化而形成非酶糖基化終端產(chǎn)物，使彈性纖維發(fā)

13、生斷裂、交聯(lián)聚集，彈性消失，最終導(dǎo)致皮膚衰老。目前，關(guān)于非酶糖基化反應(yīng)在皮膚光老化中的作用機(jī)制及相關(guān)治療藥物的報(bào)道在國(guó)內(nèi)外均比較少見(jiàn)。③成纖維細(xì)胞衰老特征:皮膚由真皮和表皮組成，其中真皮的衰老在皮膚衰老中起著至關(guān)重要的作用，因此真皮成纖維細(xì)胞的衰老對(duì)皮膚的衰老起著關(guān)鍵作用，而對(duì)皮膚成纖維細(xì)胞中的衰老相關(guān)遺傳基因的表達(dá)研究及皮膚成纖維細(xì)胞的凋亡情況研究是對(duì)細(xì)胞老化的研究的主要方面。細(xì)胞衰老主導(dǎo)基因P16在衰老過(guò)程中有P16蛋白質(zhì)的積聚，在