一株Tn5介導(dǎo)的桿狀病毒突變株的鑒定及orf66基因功能的初步研究.pdf

1、桿狀病毒是一種重要的生物殺蟲劑和基因工程的表達(dá)系統(tǒng),在基因治療中也能發(fā)揮重要的作用。目前對桿狀病毒基因組和重要基因的分子生物學(xué)已經(jīng)有了一定的認(rèn)識,但是病毒基因組中大部分基因仍然有待深入研究。Tn5介導(dǎo)的桿狀病毒AcMNPV突變庫的建立對于推進(jìn)病毒功能基因組學(xué)的研究具有重要意義。
　　 本文以從突變庫中篩選出的一株病毒復(fù)制缺陷突變株Apra165,以該突變株為研究對象,應(yīng)用AcMNPV全基因組上的88條引物分別與轉(zhuǎn)座子上的引物配對

2、組合,經(jīng)過五輪PCR和兩次測序,精確地確定該突變體中Tn5轉(zhuǎn)座子逆向插入ORF66起始密碼子ATG下游85bp處。
　　 為了排除突變株Apra165可能帶有的其他突變對病毒復(fù)制的影響,本文通過同源重組的方法構(gòu)建了攜帶egfp報告基因的orf66缺陷型定向重組Bacmid DB165,證實orf66基因處轉(zhuǎn)座子的插入確實導(dǎo)致了病毒無法復(fù)制和表達(dá)報告基因。進(jìn)一步通過系列的共轉(zhuǎn)染實驗初步說明轉(zhuǎn)座子插入破壞了病毒DNA聚合酶基因(DN

3、A-pol)的啟動子區(qū)域,影響了其正常表達(dá),從而導(dǎo)致復(fù)制缺陷,而orf66基因可能是AcMNPV非必需基因。
　　 AcMNPV ORF66有三個比較顯著的保守結(jié)構(gòu)域,分別是Desmo_N,CorA和Smc,其中CorA可能與RNA剪接相關(guān)。通過RT-PCR檢測orf66基因在sf9細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄時相,表明orf66是一晚期基因。其具體功能還有待進(jìn)一步研究。
　　 本研究對一株復(fù)制缺陷突變體,用基于AcMNPV全基因組PC