NT3通過激活C-EBPβ對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化的實驗研究.pdf

1、目的:本研究采用慢病毒攜帶NT-3（neurotrophin-3）基因轉(zhuǎn)染的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bonemarrow mesenchymal stem cells，BMSCs)，探討NT-3修飾BMSCs移植阿爾茨海默病腦內(nèi)對認(rèn)知功能和記憶力的影響，以及海馬區(qū)神經(jīng)功能修復(fù)及再生的影響。為進(jìn)一步BMSCs基因治療阿爾茨海默病提供技術(shù)和理論支持。
　　方法:
　　1.取SD大鼠股骨或脛骨骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，經(jīng)密度梯度離心法分離后進(jìn)行

2、體外培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察BMSCs形態(tài)及生長，通過傳代純化和擴(kuò)增。取第三代BMSCs流式細(xì)胞術(shù)鑒定骨髓MSCs表面的抗體CD44、CD90、CD34和CD45表達(dá)。
　　2.構(gòu)建并制備大鼠NT-3過表達(dá)慢病毒及對照慢病毒，轉(zhuǎn)染BMSCs細(xì)胞，48h后，Western Blot檢測NT-3表達(dá)情況。將NT-3過表達(dá)及干擾慢病毒轉(zhuǎn)染的BMSCs細(xì)胞與乳鼠神經(jīng)元細(xì)胞共培養(yǎng)，免疫熒光檢測NSE表達(dá)情況。MTT檢測共培養(yǎng)24h、48h、7

3、2h細(xì)胞增殖情況;實時熒光定量PCR檢測C/EBPβ mRNA表達(dá)情況;Western Blot檢測C/EBPβ蛋白表達(dá)情況。
　　3.采用雙側(cè)海馬注射Aβ1-42誘導(dǎo)AD大鼠模型，模型建立7d后，將PBS液、單一BMSCs、過表達(dá)NT-3的BMSCs、通過立體定向的方法注射到癡呆大鼠模型的雙側(cè)海馬區(qū)，隨機(jī)分成三組:PBS組、單一BMSCs組（BMSCs組）、過表達(dá)NT-3的BMSCs組（NT-3-BMSCs組），每組4只，1月后

4、水迷宮實驗檢測AD大鼠在行為學(xué)改變。
　　4.BMSCs移植1個月后，Western Blot測定大鼠海馬組織中NT-3蛋白和C/EBPβ表達(dá)情況。檢測BMSCs移植后海馬中的神經(jīng)發(fā)生，采用免疫熒光檢測海馬區(qū)βⅢ-tubulin表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　1.利用密度梯度離心法得到純度較高的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，細(xì)胞表面抗原檢測顯示大部分細(xì)胞CD44和CD90陽性，CD34和CD45陰性。
　　2.慢病毒成功轉(zhuǎn)染BM

5、SCs，Western Blot顯示BMSCs能長期穩(wěn)定表達(dá)NT-3蛋白。MTT結(jié)果顯示，與過表達(dá)對照組比較，48h及72h時間點NT-3過表達(dá)組BMSCs細(xì)胞增殖能力顯著增強(P＜0.05)，與抑制對照組比較，48h及72h時間點NT-3沉默組BMSCs細(xì)胞增殖能力顯著降低(P＜0.05);熒光定量PCR及Western Blot結(jié)果表明C/EBPβ mRNA及蛋白水平在NT-3過表達(dá)組BMSCs細(xì)胞中顯著上調(diào)，而在NT-3沉默組BM

6、SCs細(xì)胞中顯著降低(P＜0.05)。
　　3.水迷宮檢測移植NT-3修飾BMSCs或BMSCs移植治療AD模型大鼠后，與PBS組相比各組大鼠認(rèn)知和記憶能力有一定改善作用，NT-3-BMSCs組顯著改善（P＜0.05）。
　　4.BMSCs移植1個月后Western Blot檢測結(jié)果，與PBS組比較，NT-3-BMSCs組大鼠腦內(nèi)海馬組織NT-3水平明顯升高（P＜0.05），與PBS組相比，BMSCs組大鼠腦內(nèi)海馬組織中全蛋

7、白中C/EBPβ的水平顯著增加（P＜0.05），NT-3-BMSCs組中進(jìn)一步上調(diào)(P＜0.05)。
　　5.免疫熒光染色檢測結(jié)果:與PBS組相比，BMSCs組和NT-3-BMSCs組海馬組織中βⅢ-tubulin的表達(dá)升高，NT-3-BMSCs組顯著升高。
　　結(jié)論:
　　1.NT-3可能通過促進(jìn)C/EBPβ表達(dá)影響其下游相關(guān)靶基因的表達(dá)，促進(jìn)BMSCs細(xì)胞向神經(jīng)元分化，并提高細(xì)胞活力。
　　2.經(jīng)海馬移植NT