骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化中相關(guān)基因DNA甲基化狀態(tài)的研究.pdf

1、間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)具有多向分化潛能，在其分化過(guò)程中并不發(fā)生DNA序列的改變，但在不同環(huán)境或不同誘導(dǎo)條件下，可選擇性地穩(wěn)定表達(dá)某些特定的基因，其機(jī)制目前認(rèn)為是表觀遺傳學(xué)修飾的結(jié)果。DNA甲基化是表觀遺傳修飾的主要形式之一，它能夠在不改變基因組中堿基排序的前提下影響基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，但目前有關(guān)MSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化調(diào)中的相關(guān)基因的DNA甲基化修飾的改變尚不清楚，這些基因包括Oct4、神經(jīng)細(xì)胞

2、特異性微管相關(guān)蛋白Tau、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)等。
　　 Oct4因子屬于POU轉(zhuǎn)錄因子家族，是干細(xì)胞多能性控制的核心機(jī)制，在多能干細(xì)胞中高表達(dá)，分化時(shí)靜默。已有研究表明，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrowmesenchymal stem cells，BMSCs)在向神經(jīng)細(xì)胞分化前表達(dá)Oct4，分化后則檢測(cè)不到Oct4的表達(dá)；而神經(jīng)細(xì)胞特異性微管相關(guān)蛋白Tau和神經(jīng)

3、元特異性烯醇化酶NSE，在BMSCs向神經(jīng)細(xì)胞前均不表達(dá)，在分化后特異性表達(dá)。但這種改變的機(jī)制尚不清楚，是否與DNA甲基化修飾的變化有關(guān)尚待研究。本實(shí)驗(yàn)研究了BMSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化過(guò)程中Oct4、Tau和NSE基因表達(dá)的甲基化修飾的變化，以進(jìn)一步探明BMSCs的分化調(diào)控機(jī)制。
　　 目的：
　　 體外誘導(dǎo)BMSCs分化成神經(jīng)細(xì)胞，檢測(cè)分化前后的Oct4、微管相關(guān)蛋白Tau和神經(jīng)特異性烯醇化酶NSE基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)

4、改變情況，研究啟動(dòng)子區(qū)甲基化對(duì)BMSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化中Oct4、Tau和NSE基因表達(dá)的影響，探討DNA甲基化調(diào)控在BMSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化中的作用。
　　 方法：
　　 1．體外分離培養(yǎng)大鼠骨髓MSCs，通過(guò)反復(fù)傳代純化BMSCs直至第四代。
　　 2．用化學(xué)誘導(dǎo)法(BHA/DMSO)誘導(dǎo)第四代BMSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化；用肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)其向肝細(xì)胞分化。
　　 3．免疫細(xì)胞化學(xué)法鑒定分化細(xì)胞中Tau

5、、NSE和甲胎蛋白(Alpha Fetal Protein，AFP)的表達(dá)。
　　 4．提取BMSCs、BMSCs分化神經(jīng)細(xì)胞、BMSCs分化肝細(xì)胞（對(duì)照）、腦組織（對(duì)照）和肝組織（對(duì)照）的基因組DNA。亞硫酸氫鹽修飾后進(jìn)行MSP測(cè)序，檢測(cè)Oct4、Tau和NSE基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)。
　　 5．用SPSS12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。
　　 結(jié)果
　　 1．體外分離培養(yǎng)大鼠骨髓MSC

6、s至第四代，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，呈梭形，旋渦狀排列。
　　 2．BMSCs向神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)分化后，呈現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞樣形態(tài)，具有多個(gè)突起，NSE和Tau蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)染色陽(yáng)性；BMSCs向肝細(xì)胞方向誘導(dǎo)分化后，細(xì)胞集落呈貼壁或輕微粘附生長(zhǎng)，形態(tài)呈現(xiàn)片狀生長(zhǎng)肝細(xì)胞樣細(xì)胞群，AFP免疫細(xì)胞化學(xué)染色陽(yáng)性。
　　 3．MSP測(cè)序法檢測(cè)Oct4基因啟動(dòng)子區(qū)（-293bp～-85bp），包括4個(gè)CpG位點(diǎn)（-217bp、-207bp、-165b

7、p、-113bp位點(diǎn)）。甲基化修飾位點(diǎn)/CpG位點(diǎn)(％)在BMSCs、BMSCs分化神經(jīng)細(xì)胞、BMSCs分化肝細(xì)胞、腦組織和肝臟組織中均維持較高水平（均＞75％），顯著高于胚胎干細(xì)胞(0％)。Oct4啟動(dòng)子區(qū)-113bp的CpG在BMSCs維持低甲基化狀態(tài)，明顯低于BMSCs分化后的神經(jīng)細(xì)胞、BMSCs分化后的肝細(xì)胞、腦組織和肝組織。
　　 4．MSP測(cè)序法檢測(cè)Tau啟動(dòng)子區(qū)（-239bp～+131bp，含55個(gè)CpG位點(diǎn)）和N

8、SE啟動(dòng)子區(qū)（-214bp～+57bp，含30個(gè)CpG位點(diǎn)）甲基化位點(diǎn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Tau啟動(dòng)子區(qū)和NSE啟動(dòng)子區(qū)在BMSCs、BMSCs分化神經(jīng)細(xì)胞和腦組織中均保持未甲基化狀態(tài)，Tau啟動(dòng)子區(qū)未甲基化修飾位點(diǎn)占所有CpG位點(diǎn)的比率依次為98.9％、100％和100％:NSE啟動(dòng)子區(qū)依次為100％、100％和99.3％，組間無(wú)明顯差異(P＞0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1．骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化過(guò)程中，Oct4啟