人基因組近端粒序列克隆解析.pdf

1、端粒是由端粒重復序列和大量與端粒相互作用的結合蛋白組成的復合體，在真核生物線性染色體末端形成類似帽子的結構來維持染色體穩(wěn)定。端粒DNA由雙鏈和單鏈G懸突兩部分組成，人類的端粒重復單元為TTAGGG。單鏈懸突會形成D環(huán)、T環(huán)或者G四聯(lián)體的高級結構，與端粒相關結合蛋白結合提高穩(wěn)定性防止染色體末端融合或斷裂。由于末端復制的問題，端粒會隨著細胞分裂而逐漸縮短。生物體主要靠端粒酶逆轉錄延伸端粒末端，但端粒酶在大多體細胞中活性很低，當端粒縮短到臨界

2、長度時，會導致染色體降解、細胞的衰老和相關疾病的發(fā)生等，“生命時鐘”的稱呼由此而來。因此，端粒的長度是研究端粒的一個重要生物標簽。分析端粒長度的方法有很多，目前有較高分辨率和較廣應用范圍的單個端粒長度分析需要在端粒上游的近端粒區(qū)域設計特異引物，再利用PCR擴增端粒片段，進而分析端粒的長度。另一種方法也是基于PCR技術，通過在端粒末端添加接頭，結合上游特異引物擴增端粒全長的方法可以精準的獲得單個端粒長度，也同樣需要獲得近端粒序列設計上游引

3、物。
　　近端粒是在端粒和基因組核心區(qū)域之間的序列，其范圍從幾kb到幾百kb不等，存在個體間的多樣性。人類的近端粒包含靠近端粒的段落重復區(qū)域，以及和它銜接的染色體特異的非重復區(qū)域。由于近端粒區(qū)域DNA序列組成的特殊性和基因組內(nèi)部有大量端粒重復序列存在等原因，大的亞克隆沒有覆蓋近端粒區(qū)域，導致近端粒序列難以定位。NCBI的數(shù)據(jù)庫中，人類基因組全部46個染色體末端中只有17個染色體近端粒能夠完成拼接組裝，包含與端粒銜接部分序列的組裝片

4、段也只有25個。除了在端粒長度分析中的應用，近端粒序列還有例如表觀修飾、端粒相關調(diào)控和基因的遺傳和變異等研究價值。區(qū)別于酵母或水稻，人類的端粒和近端粒比較長，這也是造成近端粒克隆測序困難的原因之一。因此，克隆、測序人類的近端粒對于別的物種近端?？寺』驕y序有更廣泛的借鑒意義。
　　本實驗設計了6種策略對人類近端粒進行克隆，總結對比了其優(yōu)劣，旨在建立一種方便高效的近端粒序列克隆方法。采用“隨機引物與端粒接頭克隆近端粒序列”的方法需要相

5、對低的退火溫度，降低了端粒接頭的特異性，盡管在水稻中獲得了成功，但在人類基因組中擴增了太多的非近端粒片段?！跋拗菩悦盖信c去G懸突端粒直接克隆近端?！钡姆椒?，理論上避免了PCR擴增產(chǎn)生非特異片段的情況，但是可能由于人類端粒長度太長、連接片段數(shù)太少等問題?！跋拗菩悦盖薪宇^與端粒重復序列引物克隆近端粒序列”的方法提高了PCR的特異性，但由于基因組內(nèi)源端粒重復序列的存在，無法直接說明獲得片段是否為近端粒序列。“限制性酶切接頭與突變端粒序列引物”

6、的策略是對“限制性酶切接頭與端粒重復序列引物”降低PCR產(chǎn)物彌散程度的改進，但同樣無法排除基因組內(nèi)源端粒重復序列的干擾。為了克服內(nèi)源端粒重復序列的干擾，采用“限制性酶切接頭與端粒接頭”的策略克隆近端粒序列，排除了內(nèi)源端粒重復序列的干擾，但由于近端粒酶切位點的缺乏和人類端粒平均長度較長的問題，影響PCR的有效擴增?！吧嫌伪Ｊ匦蛄信c端粒接頭克隆近端粒序列”利用近端粒區(qū)域的同源性和人類染色體末端高頻的交叉互換，在已知的染色體近端粒區(qū)域設計引物