葡萄糖再灌注對人臍靜脈內(nèi)皮細胞氧化損傷及其機制研究.pdf

1、[背景]
　　 目前,在全球范圍內(nèi)糖尿病的患病率迅速增長。尤其在中國,糖尿病已成為一個主要的公共健康問題。而隨著糖尿病患病率的日益增高,臨床上糖尿病相關(guān)的低血糖的發(fā)生率也隨之增加。正如Cryer學(xué)者所說:“一次嚴(yán)重的醫(yī)源性低血糖或由此誘發(fā)的心血管事件可能會抵消一生維持血糖在正常范圍所帶來的益處”。低血糖對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損害,早已為人們熟知。目前,已有研究顯示,持續(xù)低血糖可誘發(fā)急性心血管疾病,加劇糖尿病大血管病變,其機制可能與低血

2、糖狀態(tài)下的神經(jīng)體液應(yīng)激反應(yīng)及持續(xù)低糖直接損傷血管內(nèi)皮細胞有關(guān)。
　　 但近年來研究發(fā)現(xiàn)低糖后補充葡萄糖至一定水平也能誘發(fā)氧化應(yīng)激,進而損傷細胞或組織。我們將這種低糖后再補充葡萄糖導(dǎo)致的細胞或組織損傷稱為葡萄糖再灌注損傷(glucose reperfusion injury)。Haces ML等學(xué)者用胰島素致大鼠低血糖后,給予25％的葡萄糖靜脈輸注,結(jié)果顯示,葡萄糖再灌注21h,血糖已經(jīng)恢復(fù)正常的情況下,仍可清晰地觀察到大鼠大腦皮

3、層的壞死細胞。葡萄糖再灌注9h和21h,大鼠腦的海馬組織、皮層、紋狀體中仍能檢測出3-NT蛋白(3-nitrotyrosine過亞硝酸鹽產(chǎn)物:3-硝基酪氨酸)表達增高。Suh等學(xué)者通過給小鼠注射胰島素引起低血糖,葡萄糖再灌注30min時檢測腦組織活性氧水平顯示,葡萄糖再灌注誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激水平高于低糖本身。該學(xué)者還發(fā)現(xiàn)低糖后葡萄糖再灌注比單純低糖對神經(jīng)細胞的損傷更大,其可能機制是NADPH氧化酶活性增加所致。內(nèi)皮細胞的損傷和功能改變與血管

4、性疾病的發(fā)生密切聯(lián)系。我科以往研究顯示,低糖能夠通過誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷內(nèi)皮細胞。但目前葡萄糖再灌注是否能導(dǎo)致血管內(nèi)皮細胞損傷,尚未見文獻報道。
　　 血管內(nèi)皮細胞的損傷和功能改變是糖尿病血管并發(fā)癥和心血管事件發(fā)生、發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。內(nèi)皮細胞中一氧化氮(Nitric Oxide,NO)生成減少是內(nèi)皮細胞功能障礙的重要標(biāo)志。大量研究證實高糖導(dǎo)致的血管內(nèi)皮損傷的機制包括胰島素抵抗、脂代謝紊亂、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等,其中高糖引起的氧化應(yīng)激起

5、關(guān)鍵作用。氧化應(yīng)激產(chǎn)生的大量氧自由基極易與NO反應(yīng),使之在瞬間滅活,從而影響血管內(nèi)皮舒張功能。同時高血糖可使血管細胞的二酯酰甘油升高,抑制NO合成酶活性,導(dǎo)致NO合成減少,并能抑制由NO介導(dǎo)的環(huán)磷鳥苷生成而引起血管舒縮功能的改變。此外,高血糖可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞凋亡,從而造成血管壁的結(jié)構(gòu)改變和血管內(nèi)皮功能障礙。同樣,在低糖對內(nèi)皮細胞損傷的研究中發(fā)現(xiàn),低糖可通過誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷血管內(nèi)皮細胞,并造成內(nèi)皮功能障礙。但目前尚未明確氧化應(yīng)激是否參與葡

6、萄糖再灌注對血管內(nèi)皮細胞的損傷作用。
　　 氧化應(yīng)激(Oxidative Stress,OS)是指由于氧自由基過量生成和/或細胞內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)受損,導(dǎo)致氧自由基及其相關(guān)代謝產(chǎn)物過量聚集,從而對細胞產(chǎn)生多種毒性作用的病理狀態(tài)。血管內(nèi)皮細胞產(chǎn)生的氧化應(yīng)激主要是由于內(nèi)源性的氧化酶如:NADPH氧化酶(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase,NOX)、黃嘌呤氧化酶、線粒體

7、電子傳遞鏈、脫耦聯(lián)的一氧化氮合酶(uncoupledendothelial nitric oxide synthase eNOS)等與抗氧化酶如:超氧化物岐化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)、過氧化氫酶(CAT)等之間的失平衡造成的。近年來大量證據(jù)表明,在血管內(nèi)皮細胞中NADPH氧化酶和脫偶聯(lián)的eNOS是氧化應(yīng)激的重要來源。其中NOX是由多個亞基組成的復(fù)合酶,包括膜亞基細胞色素b558(p22Phox和gp91Phox蛋白)、

8、多個細胞質(zhì)亞基(p47Phox、p40Phox、p67Phox)和小G蛋白Rac。它通過將NADPH的兩個電子連續(xù)傳遞給氧分子而介導(dǎo)氧化應(yīng)激的發(fā)生,該過程可表示為(2O2+NADPH-2O-2+NADP++2H+)。eNOS是內(nèi)皮型的一氧化氮合成酶,在正常情況下以二聚體的形式存在,后者能夠催化NO的合成,而在各種病理情況下,二聚體解離成單體,單體不能完成反應(yīng)過程中的電子鏈傳遞,從而則導(dǎo)致過氧化物的產(chǎn)生。后者進一步消耗細胞內(nèi)的NO產(chǎn)生毒性

9、更強的超氧亞硝酸鹽(ONOO-),ONOO-可繼續(xù)使eNOS脫偶聯(lián)損傷,從而形成惡性循環(huán)。
　　 目前已有研究證實,高糖和低糖誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞氧化應(yīng)激損傷的機制與以上兩條通路相關(guān),但葡萄糖再灌注是否對內(nèi)皮細胞也造成氧化損傷,其機制是否與NOX和脫偶聯(lián)的eNOS途徑相關(guān)?目前尚未見文獻報道,有待于進一步研究。本課題采用人臍靜脈內(nèi)皮細胞株HUVEC—12為研究對象,觀察低糖后不同濃度葡萄糖再灌注對內(nèi)皮細胞的氧化損傷作用,并就氧化應(yīng)激

10、的可能機制進行探討,為低血糖的防治提供新的實驗資料。
　　 本研究包括以下兩部分:
　　 第一章葡萄糖再灌注對人臍靜脈內(nèi)皮細胞的氧化損傷作用
　　 [目的]
　　 觀察葡萄糖再灌注對人臍靜脈內(nèi)皮細胞HUVEC-12的功能影響及氧化應(yīng)激情況。
　　 [研究對象和方法]
　　 1、以人臍靜脈內(nèi)皮細胞株HUVEC-12細胞為實驗對象。采用含10％胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng),置于37

11、℃、5％CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)。
　　 2、實驗培養(yǎng)基中葡萄糖濃度隨機分為七組:
　　 (1)正常對照組(5.5mM組,培養(yǎng)基GLU為5.5mM)；
　　 (2)持續(xù)無糖組(0mM組,培養(yǎng)基GLU為0mM)；
　　 (3葡萄糖再灌注組Ⅰ(0-5.5rmM,即先在含GLU為0mM的培養(yǎng)基中培養(yǎng)2小時后更換為GLU5.5mM的培養(yǎng)基培養(yǎng))
　　 (4)葡萄糖再灌注組Ⅱ(0—11.1mM,即先在含GLU為0m

12、M的培養(yǎng)基中培養(yǎng)2小時后更換為GLU11.1 mM的培養(yǎng)基培養(yǎng))
　　 (5)葡萄糖再灌注組Ⅲ(0-25mM,即先在含GLU為0mM的培養(yǎng)基中培養(yǎng)2小時后更換為GLU25mM的培養(yǎng)基培養(yǎng))
　　 (6)持續(xù)高糖組Ⅰ(11.1mM組,培養(yǎng)基GLU為11.1mM)
　　 (7)持續(xù)高糖組Ⅱ(25mM組,培養(yǎng)基GLU為25mM)
　　 以上各組正式干預(yù)前均采用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時,以保持各組細胞同步化生長。

13、
　　 2、分別在低糖2h后再灌注15min、30min、45min、1h、共4個不同的培養(yǎng)時間點,采用硝酸還原酶法測定NO-2、NO-3水平。
　　 3、低糖2h后再灌注15min化學(xué)比色法測定eNOS活性。
　　 4、分別在低糖2h后再灌注15min、30min、45min、1h、共4個不同的培養(yǎng)時間點,利用超氧化物陰離子熒光探針熒光探(Dihydroethidium,DHE),微孔板檢測系統(tǒng)(Spectra

14、Max M5/M5e)在激發(fā)波535nm,發(fā)射波610nm測定細胞內(nèi)熒光量的變化,間接反映ROS產(chǎn)量。
　　 5、實驗數(shù)據(jù)計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示,采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計分析,數(shù)據(jù)采用連續(xù)性重復(fù)測量的方差分析和單因素方差分析(One-wayANOVA);多重比較采用LSD法。同時考慮處理分組和重復(fù)測量的時間點兩個因素。P<0.05被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 [結(jié)果]
　　 1.各組

15、細胞外不同時間點NO水平的測定:七組間的NO水平在各個時間點都存在顯著性差異(組間效應(yīng):F=1936.989,P=0.000；組內(nèi)效應(yīng):F=43.040,P=0.000)。具體分析如下:
　　 (1)濃度效應(yīng):①在同一時間點中,與5.5mM組比較,0mM組、11.1mM組、25mM組的NO水平都顯著下降,P<0.05。②再灌注組與持續(xù)無糖組、持續(xù)高糖組的NO水平比較:同一時間點中0-11.1mM組<0mM組；0-25mM組<0m

16、M組,P<0.05。在15min和30min時0-11.1mM組<11.1mM組；0-25mM組<25mM組,P<0.05。③三組不同濃度再灌注組NO水平比較:同一時間點中0-25mM組<0-11.1mM組<0.5.5mM組,P<0.05。
　　 (2)時間效應(yīng):隨著時間的延長,0-5.5mM組NO水平逐漸恢復(fù)至正常水平,其余各組的NO水平呈逐漸下降趨勢,在再灌注1h各組值基本下降至同一水平。
　　 2.各組細胞eNOS

17、活性的測定:七組細胞的eNOS活性存在顯著性差異(F值=38.636,P=0.000)(1)與5.5mM組:(8.740±0.507)比較,0mM組(4.971±0.545)、11.1mM組(5.468+0.806)、25mM組(4.830±0.168)的eNOS活性都顯著下降,P=0.000。(2)再灌注組與持續(xù)無糖組、持續(xù)高糖組的eNOS活性比較:0-25mM組<0mM組,P=0.000。0-11.1mM組<11.1mM組；0-25

18、mM組<25mM組,P=0.000。(3)不同濃度再灌注組eNOS活性比較:0-25mM組(2.040±0.437)<0.11.1mM組(3.983±0.717)<0.5.5mM組(7.677±0.891),P=0.000。
　　 3.各組細胞不同時間點ROS水平測定:七組間的ROS水平在各個時間點都存在顯著性差異(組間效應(yīng):F=70.086,P=0.000；組內(nèi)效應(yīng):F=7.309,P=0.009)。具體分析如下:
　　

19、 (1)濃度效應(yīng):①在同一時間點中,與5.5mM組比較,0mM組、25mM組的ROS水平都顯著升高,P<0.05。②再灌注組與持續(xù)無糖組、持續(xù)高糖組的ROS水平比較:同一時間點中0-25mM組>0mM組,P<0.05；0-25mM組>25mM組,P<0.05。③三組不同濃度再灌注組ROS水平比較:同一時間點中0-25mM組>0.5.5mM組:0-25mM組>0-11.1mM組,P<0.05。
　　 (2)時間效應(yīng):隨著時間的延

20、長,0mM組、25mM組、0-25mM組的ROS水平呈現(xiàn)逐漸遞增的趨孰但各時間之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 4.相關(guān)性分析:HUVEC-12細胞中,ROS水平與NO水平存在顯著性負(fù)相關(guān),(r=0.-0.733,P=0.000,N=21),NO水平與eNOS活性存在顯著性正相關(guān)(r=0.951,P=0.000,N=21),ROS水平與eNOS活性存在顯著性負(fù)相關(guān)(r=-0.801,P=0.000,N=21)NO水平與再灌注濃度存在

21、顯著性負(fù)相關(guān)(r=-0.802,P=0.000,N=36)ROS水平與再灌注濃度存在顯著性正相關(guān)(r=0.902,P=0.000,N=36)。
　　 [結(jié)論]
　　 1.低糖后葡萄糖再灌注能夠?qū)е翲UVEC-12細胞功能障礙及氧化應(yīng)激,這種損傷作用比單純低糖和單純高糖更嚴(yán)重。
　　 2.葡萄糖再灌注濃度越高,HUVEC-12細胞氧化應(yīng)激水平越高,功能障礙越嚴(yán)重。
　　 3.葡萄糖再灌注引起的HUVEC-1

22、2細胞NO水平變化、eNOS活性與ROS含量呈負(fù)相關(guān),提示葡萄糖再灌注導(dǎo)致的內(nèi)皮細胞功能障礙可能與氧化應(yīng)激相關(guān)。
　　 第二章葡萄糖再灌注誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細胞氧化應(yīng)激的機制初探
　　 [目的]
　　 1、觀察葡萄糖再灌注對人臍靜脈內(nèi)皮細胞抗氧化能力的影響。
　　 2、了解NADPH氧化酶和脫耦聯(lián)的eNOS在葡萄糖再灌注誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞氧化應(yīng)激中的作用。
　　 [研究對象和方法]
　　 1、以

23、人臍靜脈內(nèi)皮細胞株HUVEC-12細胞為實驗對象。
　　 2、總抗氧化能力檢測實驗分組同第一部分。其余實驗分組如下:
　　 (1)正常對照組(5.5 mM組,培養(yǎng)基GLU為5.5mM)；
　　 (2)葡萄糖再灌注組(O-25mM組,即先在含GLu為0mM的培養(yǎng)基中培養(yǎng)2小時后更換GLu為25mM的培養(yǎng)基培養(yǎng))；
　　 (3)葡萄糖再灌注組聯(lián)合Apocynin處理組(APO組:以500umol/l的apoc

24、ynin預(yù)孵育1hr后再加入0mM的培養(yǎng)基培養(yǎng)2h,之后更換GLU為25mM的培養(yǎng)基培養(yǎng))；
　　 (4)葡萄糖再灌注聯(lián)合L-NAME處理組(L—NAME組:以100umol/l的L-NAME預(yù)孵育1hr后再加入0mM的培養(yǎng)基培養(yǎng)2h,之后更換GLU為25mM的培養(yǎng)基培養(yǎng))。
　　 以上各組正式干預(yù)前均采用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時,以保持各組細胞同步化生長,每組經(jīng)過低糖2h后再灌注15min進行檢測。
　　 3、

25、實驗方法:用化學(xué)比色法測定細胞的總抗氧化能力,用熒光探針法測定細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)量。
　　 4、實驗數(shù)據(jù)計量資料以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示,采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行處理,各組均數(shù)比較采用單向方差分析(One-way ANOVA),組內(nèi)多重比較采用LSD法。P<0.05被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 [結(jié)果]
　　 1、總抗氧化能力(TAO-C)的測定:七組間的細胞總抗氧化能力存在顯著性差異(F=20

26、.217,P=0.000)。(1)與5.5mM組(1.592±0.247),0mM組(0.571±0.090)、11.1mM組(0.860±0.272)、25mM組(0.625±0.127)的TAO-C都顯著下降,P=0.001。
　　 (2)再灌注組與持續(xù)無糖組、持續(xù)高糖組的TAO—C比較:0mM組>0-25mM組:0mM組<0-11.1mM組,P=0.042、P=0.025。25mM組>0-25mM組,P=0.022。

27、>　　 (3)不同濃度再灌注組TAO-C比較:0-5.5mM組(1.477±0.214)>0-11.1mM組(0.960±0.195)>0-25mM組(0.224±0.094),P=0.005、P=0.000。
　　 2、加入抑制劑后ROS測定:5.5mM組,0-25mM組,APO組,L-NAME組的ROS水平分別為:0.663±0.124、1.398±0.132、0.789±0.054、0.917±0.058四組間存在顯著性

28、差異(F=31.99,P=0.000),與5.5mM組相比,0-25mM組ROS水平均顯著升高,經(jīng)過抑制劑APO和L-NAME處理后,APO組和L-NAME組的ROS水平分別下降(44％和34％),P=0.000。
　　 3、加入抑制劑后總抗氧化能力(TAO-C)測定:5.5mM組,0-25mM組,APO組,L-NAME組的TAO-C分別為:1.278±0.089、0.308±0.128、1.071±0.132、0.684±0.

29、111。四組間存在顯著性差異(F=24.027,P=0.000),與5.5mM組相比,0-25mM組TAO-C水平均顯著下降,經(jīng)過抑制劑APO和L-NAME處理后,APO組和L-NAME組的TAO-C水平分別上升(3.38倍和2.19倍),P=0.000和P=0.01。
　　 [結(jié)論]
　　 1.葡萄糖再灌注可導(dǎo)致HUVEC-12細胞總抗氧化能力下降。
　　 2.葡萄糖再灌注誘導(dǎo)HUVEC-12細胞氧化應(yīng)激的機制