沉默CD133基因?qū)D133+肝癌干細(xì)胞放射敏感性的影響.pdf

1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模豪寐《境聊珻D133基因探討其對(duì)人肝癌CD133+-HepG2干細(xì)胞放射敏感性的影響。
　　 第一部分:CD133+-HepG2細(xì)胞的分選及“干性”鑒定
　　 實(shí)驗(yàn)方法:利用免疫磁珠分選技術(shù)從HepG2肝癌細(xì)胞系中分選出CD133+及CD133-細(xì)胞亞群，并用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)分選前后CD133的表達(dá)率;對(duì)分選得到的CD133+-HepG2肝癌細(xì)胞進(jìn)行體外成球能力及NOD/SCID小鼠皮下成瘤能力檢測(cè)，并取皮下

2、移植瘤進(jìn)行HE染色觀察腫瘤組織結(jié)構(gòu);克隆形成試驗(yàn)對(duì)比CD133+細(xì)胞與CD133-細(xì)胞克隆形成能力。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:從HepG2肝癌細(xì)胞系中利用免疫磁珠分選技術(shù)成功分選出CD133+與CD133-細(xì)胞，并用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HepG2細(xì)胞的CD133基礎(chǔ)表達(dá)率為(1.36±0.20)％，通過(guò)分選后CD133表達(dá)率上升到(87.62±1.92)％。隨后無(wú)血清培養(yǎng)結(jié)果顯示CD133+HepG2細(xì)胞能在含EGF、FGF、LIF的無(wú)血清培

3、養(yǎng)液中能成球生長(zhǎng)，而CD133--HepG2細(xì)胞則無(wú)法在相同的培養(yǎng)液中生存。小鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示1×103個(gè)CD133+細(xì)胞即可在NOD/SCID小鼠皮下形成移植瘤，而相同條件下CD133細(xì)胞均也不能成瘤。HE染色結(jié)果顯示，由CD133+細(xì)胞形成的皮下移植瘤在顯微鏡下組織細(xì)胞呈排列致密，細(xì)胞核清晰可見(jiàn)。平板克隆形成試驗(yàn)顯示，CD133+細(xì)胞比CD133細(xì)胞具有更強(qiáng)的克隆形成能力，其克隆形成率為:35.03±2.35％，而CD133-

4、細(xì)胞克隆形成率僅為:6.4±0.72％。兩者具有顯著差異，P＜0.01。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)論:上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明通過(guò)免疫磁珠分選得到的CD133+-HepG2細(xì)胞比CD133--HepG2細(xì)胞具有更強(qiáng)的體外成球和體內(nèi)成瘤能力及克隆形成能力，是具有腫瘤干細(xì)胞特性的肝癌細(xì)胞亞群。
　　 第二部分?jǐn)y帶CD133干擾序列的慢病毒感染CD133+-HepG2
　　 實(shí)驗(yàn)方法:利用慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)，以CD133基因?yàn)槌聊?/p>

5、靶點(diǎn)，按預(yù)實(shí)驗(yàn)得出的MOI值20對(duì)CD133+-HepG2肝癌細(xì)胞進(jìn)行感染，以轉(zhuǎn)染shCD133組為實(shí)驗(yàn)組、轉(zhuǎn)染shNC組為陰性對(duì)照組，未處理的CD133+-HepG2細(xì)胞為空白對(duì)照組;3天后在熒光顯微鏡下觀察慢病毒的感染效率;克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)三組細(xì)胞克隆形成能力;RT-PCR和Western Blot檢測(cè)三組細(xì)胞CD133 mRNA及蛋白的表達(dá);
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:接種慢病毒后3天，在倒置熒光顯微鏡觀察到綠色熒光蛋白(GFP)的

6、表達(dá)，第5天達(dá)到高峰，其感染陽(yáng)性效率達(dá)80％以上:克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示沉默CD133后的CD133+肝癌干細(xì)胞增殖能力明顯減弱(P＜0.01);RT-PCR和Western Blot結(jié)果顯示慢病毒介導(dǎo)的CD133shRNA能有效下調(diào)CD133的mRNA和蛋白表達(dá)(P＜0.01);
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)論:上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明慢病毒介導(dǎo)的shRNA能顯著下調(diào)CD133+肝癌干細(xì)胞CD133的表達(dá)，并能顯著抑制其增殖能力。
　　 第三部

7、分克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞放射敏感性并探討其可能機(jī)制。
　　 實(shí)驗(yàn)方法:采用克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞克隆形成率(Platingefficiency PE)，PE=克隆數(shù)目/接種細(xì)胞數(shù)×100％，以及存活分?jǐn)?shù)(survival fraction SF)，SF=受照射細(xì)胞的克隆形成率/對(duì)照組細(xì)胞克隆形成率×100％。繪制劑量存活曲線并計(jì)算放射生物學(xué)參數(shù)。利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)三組細(xì)胞細(xì)胞周期及凋亡情況。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:陽(yáng)性感染

8、組的劑量存活曲線較其他兩組整體下移。根據(jù)多靶單擊模型計(jì)算出各組SF2、D0、Dq及N值結(jié)果表明，陽(yáng)性感染組的PE、SF、SF2、D0、Dq及N值均較空白組和陰性感染組明顯減小，其放射增敏比(SER)為:1.37±0.02。差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜0.01。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞周期及凋亡情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性感染組其S期明顯減少G2期增多，細(xì)胞凋亡也明顯增加。差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P＜0.05。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)論:沉默CD133基因后，CD