牛卵母細胞體外成熟培養(yǎng)的研究.pdf

1、卵母細胞體外成熟技術(shù)是體外生產(chǎn)胚胎的基礎(chǔ)，獲得大量體外成熟卵母細胞將為體外受精及胚胎移植提供更多優(yōu)質(zhì)胚胎。雖然牛卵母細胞體外成熟培養(yǎng)技術(shù)已趨于成熟和完善，但卵母細胞成熟機理的研究還有待深入。本文對比了添加尿嘧啶和三價因子等試劑對牛卵母細胞成熟及后期發(fā)育的影響、觀察了不同組之間成熟牛卵母細胞和孤雌激活胚胎顯微結(jié)構(gòu)變化和不同組之間顆粒細胞凋亡情況。旨在探討成熟液中添加尿嘧啶和三價因子等試劑對牛卵母細胞成熟的影響。 1、牛卵母細胞體外

2、成熟實驗分為3組：基礎(chǔ)成熟液為對照組，基礎(chǔ)成熟液添加50μg/mL尿嘧啶和10μL/mL三價因子為第一組，基礎(chǔ)成熟液添加0.67mg/mLATP為第二組。結(jié)果顯示第一組顆粒細胞完全擴散的卵母細胞率(87.31％)顯著高于第二組(70.54％)(P＜0.05)，極顯著高于對照組(68.67％)(P＜0.01)。第二組顆粒細胞完全擴散的卵母細胞率(70.54％)高于對照組(68.67％)，但差異不顯著(P＞0.05)。第一組卵母細胞成熟率(

3、72.65％)、卵裂率(55.56％)和8～16細胞率(35.56％)極顯著高于對照組(57.92％、43.88％和24.59％)(P＜0.01)；第二組卵母細胞成熟率(60.39％)與對照組(57.92％)差異不顯著(P＞0.05)，但卵裂率和8～16細胞率差異顯著(P＜0.05)。第一組和第二組之間成熟率和卵裂率差異顯著(P＜0.05)；但8～16細胞率差異不顯著(P＞0.05)。通過JC-1染色，第一組具有JC-1熒光的牛卵母細胞

4、百分率(51.11％)顯著高于第二組(40.00％)，極顯著高于對照組(33.33％)。第二組具有JC-1熒光的牛卵母細胞百分率高于對照組但差異不顯著(P＞0.05)。尿嘧啶和三價因子能夠促進卵丘顆粒細胞的擴散，提高牛卵母細胞成熟率、卵裂率和8～16細胞率，并能提高線粒體活性，促進胚胎發(fā)育。 2、電子顯微鏡觀察成熟后牛卵母細胞及孤雌激活胚胎超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示：三組顆粒細胞變化不明顯，卵母細胞和孤雌激活胚胎線粒體雙層膜都不明顯，空

5、泡變性較多。第一組成熟卵母細胞線粒體電子密度最接近卵母細胞胞質(zhì)，且比對照組和第二組豐富。第一組孤雌激活胚胎可見卵黃顆粒向細胞表面靠近，伸入透明帶內(nèi)的微絨毛基本消退，透明帶出現(xiàn)縱向裂痕。第二組成熟卵母細胞線粒體量比對照組豐富，可見顆粒細胞突起伸進透明帶。成熟卵母細胞線粒體電子密度增大，細胞表面微絨毛豐富。8～16細胞孤雌激活胚胎中可見細胞間連接。尿嘧啶和三價因子能夠保護卵母細胞和孤雌激活胚胎的線粒體，提高線粒體的活性。 3、地衣紅

6、染色結(jié)果顯示，三組的顆粒細胞都存在凋亡現(xiàn)象。DNA電泳時梯度條帶并不明顯，結(jié)合流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，第一組和第二組顆粒細胞凋亡率分別為30.46％和44.76％，對照組細胞凋亡率為33.28％。細胞周期結(jié)果顯示：第一組G1期為65.23％，G2期為14.66％，S期為20.11％；第二組G1期為66.22％，G2期為10.54％，S期為23.25％；而對照組G1期為60.93％，G2期為17.73％，S期為21.34％。數(shù)據(jù)顯示，實驗