高濃度胰島素對(duì)腎小管上皮細(xì)胞白蛋白、葡萄糖重吸收的影響.pdf

1、目的：糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）為糖尿病特征性微血管并發(fā)癥之一，但其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，且2型糖尿病腎病病理表現(xiàn)差異很大。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為其早期病變主要累及腎小球，并將微量白蛋白尿（microalbuminuria，MAU）作為早期臨床診斷指標(biāo)，但越來(lái)越多的研究顯示糖尿病腎病在腎小球出現(xiàn)明顯損傷之前已存在腎小管及間質(zhì)的結(jié)構(gòu)及功能損傷，臨床主要表現(xiàn)為腎小管性蛋白尿及酶尿，甚至有研究在 STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠中觀察到

2、早期白蛋白尿源于腎小管損傷導(dǎo)致的重吸收功能受損，而非源自腎小球。此外，腎小管間質(zhì)損傷與慢性腎臟病（chronic kidney disease，CKD）導(dǎo)致的腎小球?yàn)V過(guò)率（glomerular filtration rate，GFR）下降及腎功能惡化的關(guān)系更加密切。因此，腎小管損傷在糖尿病腎病中的發(fā)生原因、機(jī)制及其結(jié)構(gòu)功能改變應(yīng)受到重視。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，78.2％的 DM患者在尿微量白蛋白升高前，已出現(xiàn)不同程度的腎小管功能異常，以高脂

3、飼料喂養(yǎng) OLETF大鼠誘導(dǎo)的2型糖尿病模型，在糖耐量減低期（impaired glucose tolerance，IGT）即已出現(xiàn)明顯的腎小管上皮細(xì)胞及間質(zhì)微血管的病理?yè)p傷，且尿中反映腎小管損傷的指標(biāo)：尿視黃醇結(jié)合蛋白（RBP）、N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶（NAG）和中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)載脂蛋白（NGAL）等排泄增加，但腎小球的結(jié)構(gòu)及反映其功能的血液、尿液生化指標(biāo)未見(jiàn)明顯異常。那么在糖尿病前期，導(dǎo)致腎小管結(jié)構(gòu)及功能損傷的原因是什么？

4、胰島素抵抗/高胰島素血癥是CKD發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。有研究發(fā)現(xiàn)高胰島素對(duì)腎臟的損害在血糖升高前即已開(kāi)始。IGT期一個(gè)重要的病理生理變化就是胰島素抵抗（insulin resistance，IR）及在此基礎(chǔ)上逐漸出現(xiàn)的代償性高胰島素血癥。這種代償升高的胰島素雖然有助于控制血糖，但過(guò)高的胰島素對(duì)腎臟等其它組織卻是有害的。那么在血糖尚未明顯升高之前，以胰島素抵抗/高胰島素血癥為主要特征的代謝紊亂是否會(huì)影響腎小管的結(jié)構(gòu)及功能，參與糖尿病腎病的發(fā)

5、生發(fā)展？腎臟在體內(nèi)糖代謝過(guò)程中也發(fā)揮重要作用。所有的腎小球細(xì)胞和腎小管細(xì)胞均存在胰島素受體。腎臟正常的胰島素信號(hào)通路依賴(lài)胰島素與其細(xì)胞膜受體的結(jié)合，并激活一系列細(xì)胞內(nèi)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)而發(fā)揮效應(yīng)。因此我們推測(cè)，高濃度胰島素可能通過(guò)胰島素信號(hào)通路影響腎小管功能。本研究以大鼠近端腎小管上皮細(xì)胞株（NRK-52E）為研究對(duì)象，觀察在不同胰島素濃度及不同干預(yù)時(shí)間作用下，腎小管上皮細(xì)胞對(duì)白蛋白及葡萄糖重吸收的變化，以及介導(dǎo)白蛋白（megalin，cubi

6、lin）及葡萄糖（SGLT2，GLUT2，SGLT1， GLUT1）重吸收的受體表達(dá)的變化，同時(shí)探討 INS/IRS-1/PI3K/Akt通路在其中的參與作用。
　　方法：⑴MTT法檢測(cè)不同濃度的胰島素對(duì)NRK-52E細(xì)胞活力的影響，并結(jié)合胰島素的生理濃度以確定其干預(yù)濃度，并進(jìn)一步分為對(duì)照組、胰島素低濃度組、中等濃度組及高濃度組。⑵不同濃度的胰島素作用于 NRK-52E細(xì)胞24h后，運(yùn)用免疫熒光法、熒光定量PCR（Fluoresc

7、ent quantitative PCR，F(xiàn)Q-PCR）和蛋白免疫印跡（Western Blot，WB）技術(shù)分別從基因和蛋白水平檢測(cè)megalin，cubilin，SGLT2，GLUT2， SGLT1及GLUT1受體表達(dá)量的變化。⑶以高濃度胰島素干預(yù)細(xì)胞不同時(shí)間（0，1h，6h，12h，24h，48h）后，分別用免疫熒光、熒光定量PCR和Western Blot法檢測(cè)megalin，cubilin，SGLT2， GLUT2，SGLT1及

8、GLUT1受體表達(dá)量的變化。⑷應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡觀察NRK-52E細(xì)胞吞飲異硫氰酸四甲基羅丹明標(biāo)記的牛血清白蛋白(TRITC-albumin)的變化。⑸應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡觀察NRK-52E細(xì)胞吞飲熒光標(biāo)記2-脫氧葡萄糖（2-NDBG）的變化。⑹應(yīng)用FQ-PCR和Western Blot法檢測(cè)在不同濃度的胰島素及不同干預(yù)時(shí)間作用下，NRK-52E細(xì)胞IRS-1、PI3K及Akt的變化。⑺設(shè)置對(duì)照組、PI3K抑制劑組與高濃度胰島素干預(yù)組

9、，應(yīng)用免疫熒光法觀察各組對(duì) TRITC-albumin、2-NDBG的重吸收及各受體蛋白的變化趨勢(shì)并進(jìn)行比較。
　　結(jié)果：①結(jié)合MTT法檢測(cè)結(jié)果，確定胰島素干預(yù)濃度：0 ng/ml（對(duì)照組），5ng/ml（低濃度干預(yù)組，相當(dāng)于生理濃度），10 ng/ml（中等濃度干預(yù)組），50ng/ml（高濃度干預(yù)組）。②不同胰島素濃度干預(yù)下，NRK-52E細(xì)胞的megalin與cubilin表達(dá)量均在低濃度干預(yù)組最大（P<0.05），以后逐漸減

10、少，至高濃度干預(yù)組表達(dá)最少。二者在干預(yù)時(shí)間為0-6h逐漸增加，至6h最大（P<0.05），此后逐漸減少，至48h最少。③NRK-52E細(xì)胞對(duì)白蛋白的攝取與胰島素濃度有關(guān)，在胰島素干預(yù)濃度為5ng/ml時(shí)最大（P<0.05），此后隨干預(yù)濃度的增加，攝取量逐漸減少。④不同胰島素濃度干預(yù)下，NRK-52E細(xì)胞SGLT2與GLUT2的表達(dá)呈濃度依賴(lài)性增加，GLUT1僅在高濃度胰島素干預(yù)組表達(dá)量增加，SGLT1未見(jiàn)明顯變化。不同干預(yù)時(shí)間條件下，各

11、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體的最高表達(dá)量均出現(xiàn)在干預(yù)6h（P<0.05），此后雖有減少，但仍較對(duì)照組高。⑤NRK-52E細(xì)胞對(duì)葡萄糖的吞飲量隨胰島素濃度的增加而增加。⑥高濃度胰島素條件下，腎小管上皮細(xì)胞的胰島素信號(hào)通路 IRS-1、PI3-K及Akt的活性受到抑制（P<0.05）。
　　結(jié)論：⑴高濃度胰島素條件下，腎小管上皮細(xì)胞胰島素信號(hào)通路 IRS-1/PI3-K/Akt受到抑制。⑵高濃度胰島素通過(guò)抑制信號(hào)通路 IRS-1/PI3-K/Akt，