甲狀旁腺素對人腎小管上皮細(xì)胞凋亡和轉(zhuǎn)分化的影響.pdf

1、目的：腎間質(zhì)纖維化是各種原因所致的慢性腎臟病進(jìn)展為終末期腎病的共同途徑。腎小管間質(zhì)病變的嚴(yán)重程度與慢性腎臟病的進(jìn)展及預(yù)后密切相關(guān)。因此，對腎間質(zhì)纖維化發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制及其防治的研究已成為目前腎臟病領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。作為腎小管間質(zhì)結(jié)構(gòu)的主要細(xì)胞之一，腎小管上皮細(xì)胞不僅是疾病進(jìn)展中的受損者，而且是間質(zhì)炎癥、纖維化的積極參與者。研究表明，腎小管上皮細(xì)胞凋亡和轉(zhuǎn)分化在腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用。腎小管上皮細(xì)胞凋亡導(dǎo)致腎小管細(xì)胞丟失、腎

2、小管萎縮。腎小管上皮細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化后，進(jìn)入腎間質(zhì)，一方面導(dǎo)致腎小管細(xì)胞丟失，腎小管萎縮；另一方面，肌成纖維細(xì)胞分泌大量的細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞因子、趨化因子，促進(jìn)腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)展。阻止或逆轉(zhuǎn)腎小管上皮細(xì)胞的凋亡和轉(zhuǎn)分化過程，可能成為防治腎間質(zhì)纖維化的新途徑。
　　 在慢性腎臟病早期，多數(shù)患者的血清甲狀旁腺素（PTH）水平就已顯著增高。很多腎臟病學(xué)者已經(jīng)認(rèn)識到過度增高的PTH可看作是一種尿毒癥毒素，不僅影響骨質(zhì)代謝，導(dǎo)致腎性

3、骨病，而且對心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和紅細(xì)胞生成等均產(chǎn)生負(fù)性影響，但PTH對腎臟本身的影響，尚未引起足夠的重視。研究表明，某些尿毒癥毒素，如晚期糖基化終末產(chǎn)物、甲基胍、硫酸吲哚酚、瘦素等對腎小管間質(zhì)的損傷具有加劇作用，從而促進(jìn)了腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)展。PTH作為尿毒癥毒素之一，是否影響腎小管上皮細(xì)胞凋亡和轉(zhuǎn)分化過程，目前國內(nèi)外少見報(bào)道。
　　 1，25（OH）2D3，又稱為活性維生素D3，是調(diào)節(jié)體內(nèi)鈣磷代謝的重要激

4、素。最近研究發(fā)現(xiàn)，它還具有調(diào)節(jié)細(xì)胞的增生、分化、凋亡、以及介導(dǎo)免疫反應(yīng)等生物學(xué)效應(yīng)。文獻(xiàn)報(bào)道，應(yīng)用1，25（OH）2D3類似物帕立骨化醇（paricalcitol）能夠減輕單側(cè)輸尿管梗阻模型的腎小管間質(zhì)損傷。1，25（OH）2D3能夠抑制TGF-β1誘導(dǎo)的腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）和Ⅰ型膠原的表達(dá)上調(diào)，因此推測1，25（OH）2D3具有抗腎間質(zhì)纖維化的潛能。但1，25（OH）2D3是否能夠拮抗PTH對腎小管上皮細(xì)胞

5、凋亡和轉(zhuǎn)分化的影響，目前國內(nèi)外尚未見報(bào)道。
　　 本課題利用體外培養(yǎng)的人近端腎小管上皮細(xì)胞（HK-2細(xì)胞株），研究PTH對其凋亡、轉(zhuǎn)分化、細(xì)胞外基質(zhì)的分泌和降解、以及致纖維化細(xì)胞因子轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）表達(dá)的影響，以探討PTH在腎間質(zhì)纖維化發(fā)病機(jī)制中的作用。并進(jìn)一步研究1，25（OH）2D3對PTH誘導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化和TGF-β1表達(dá)的拮抗作用，為防治腎間質(zhì)纖維化提供新的思路。
　　 方法：

6、>　　 1.HK-2細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定
　　 HK-2細(xì)胞株來源于美國ATCC司，細(xì)胞培養(yǎng)于含10％胎牛血清（FCS）的DMEM/F12培養(yǎng)液中，37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)，每隔1～2天換液1次，應(yīng)用0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA消化傳代，每5～6天傳代1次。用倒置相差顯微鏡、掃描電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測細(xì)胞角蛋白-18（CK-18）、α-SMA的表達(dá)以進(jìn)行細(xì)胞鑒定。
　　 2.PTH對HK-2細(xì)胞

7、凋亡的影響
　　 （1）藥物干預(yù)：將HK-2細(xì)胞培養(yǎng)于含5％ FCS的DMEM/F12培養(yǎng)液中，試驗(yàn)前應(yīng)用無血清培養(yǎng)液同步化24 h，分別加入終濃度為0、10-12、10-11、10-10、10-9、10-8 mol/L PTH的無血清DMEM/F12培養(yǎng)液刺激HK-2細(xì)胞48 h，或10-8 mol/L PTH刺激HK-2細(xì)胞不同時間（0、12、24、48、72 h）。
　　 （2）Hoechst33258染色共聚焦顯

8、微鏡觀察HK-2細(xì)胞核形態(tài)學(xué)的改變。
　　 （3）Annexin V/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測HK-2細(xì)胞的凋亡百分率。
　　 （4）Western blot法檢測HK-2細(xì)胞中Bax和Bcl-2的蛋白表達(dá)。
　　 （5）半定量RT-PCR法檢測HK-2細(xì)胞中Bax和Bcl-2的基因表達(dá)。
　　 3.PTH對HK-2細(xì)胞轉(zhuǎn)分化和TGF-β1表達(dá)的影響
　　 （1）藥物干預(yù)：將HK-2細(xì)胞培養(yǎng)于含5％

9、 FCS的DMEM/F12培養(yǎng)液中，試驗(yàn)前應(yīng)用無血清培養(yǎng)液同步化24 h，分別加入終濃度為0、10-12、10-11、10-10、10-9、10-8 mol/L PTH的含5％ FCS的DMEM/F12培養(yǎng)液刺激HK-2細(xì)胞48 h，或10-8 mol/L PTH刺激HK-2細(xì)胞不同時間（0、12、24、48、72 h）。
　　 （2）倒置相差顯微鏡、掃描電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。
　　 （3）免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測HK-2細(xì)

10、胞中α-SMA的表達(dá)。
　　 （4）Western blot法檢測細(xì)胞中α-SMA、TGF-β1的蛋白表達(dá)。
　　 （5）半定量RT-PCR法檢測HK-2細(xì)胞中α-SMA、TGF-β1的基因表達(dá)。
　　 4.PTH對HK-2細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)的合成與降解的影響
　　 （1）藥物干預(yù)：將HK-2細(xì)胞培養(yǎng)于含5％ FCS的DMEM/F12培養(yǎng)液中，試驗(yàn)前應(yīng)用無血清培養(yǎng)液同步化24 h，分別加入終濃度為0、10-1

11、2、10-11、10-10、10-9、10-8 mol/L PTH的含5％ FCS的DMEM/F12培養(yǎng)液刺激HK-2細(xì)胞48 h，或10-8 mol/L PTH刺激HK-2細(xì)胞不同時間（0、12、24、48、72 h）。
　　 （2）Western blot法檢測HK-2細(xì)胞中Ⅲ型膠原的蛋白表達(dá)。
　　 （3）ELISA法檢測HK-2細(xì)胞培養(yǎng)上清液中纖維連接蛋白的含量。
　　 （4）半定量RT-PCR法檢測HK

12、-2細(xì)胞中Ⅲ型膠原、纖維連接蛋白、纖溶酶原激活物抑制物-1（PAI-1）、基質(zhì)金屬蛋白酶-1（MMP-1）、金屬蛋白酶組織抑制劑-1（TIMP-1）的基因表達(dá)。
　　 51，25（OH）2D3對PTH誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞轉(zhuǎn)分化和TGF-β1表達(dá)的影響
　　 （1）藥物干預(yù)：HK-2細(xì)胞培養(yǎng)于含5％FCS的DMEM/F12培養(yǎng)液中，試驗(yàn)前應(yīng)用無血清培養(yǎng)液同步化24 h。實(shí)驗(yàn)分組：（1）對照組，加入等體積含5％FCS的DMEM

13、/F12培養(yǎng)液；（2） PTH刺激組：加入終濃度為10-10mol/L PTH的含5％FCS的DMEM/F12培養(yǎng)液；（3）1，25（OH）2D3干預(yù)組：加入10-10 mol/L PTH，同時加入不同濃度（10-10、10-9、10-8、10-7mol/L）的1，25（OH）2D3，刺激HK-2細(xì)胞48 h。
　　 （2）免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測HK-2細(xì)胞中α-SMA的表達(dá)。
　　 （3）Western blot法檢測HK

14、-2細(xì)胞中α-SMA、TGF-β1的蛋白表達(dá)。
　　 （4）半定量RT-PCR法檢測HK-2細(xì)胞中α-SMA、TGF-β1的基因表達(dá)。
　　 結(jié)論：
　　 1.PTH可促進(jìn)體外培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生凋亡，其作用可能通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因Bax和Bcl-2的表達(dá)發(fā)揮作用。
　　 2.PTH可促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化成肌成纖維細(xì)胞，促進(jìn)TGF-β1的表達(dá)，因而在腎間質(zhì)纖維化的發(fā)病機(jī)制中可能起著重要作用。