水貂阿留申病毒VP2蛋白適配體的篩選與初步應(yīng)用研究.pdf

1、水貂阿留申病(Aleutian Mink Disease，AD)是由水貂阿留申病毒(Aleutian Mink Disease Virus，AMDV)感染引起的自身免疫功能發(fā)生紊亂、衰竭的慢性持續(xù)性傳染病。該病引起幼貂死亡和成年貂貂皮質(zhì)量和生殖力下降，嚴(yán)重影響了水貂養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。針對(duì)該病目前沒(méi)有商品化疫苗，貂場(chǎng)主要通過(guò)定期篩查、檢疫、淘汰陽(yáng)性個(gè)體達(dá)到種群的凈化。隨著我國(guó)水貂養(yǎng)殖業(yè)的飛速發(fā)展，開(kāi)展水貂的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物化研究迫在眉睫，開(kāi)展疫病診斷

2、和治療制劑研究前景廣闊。
　　核酸適配體是從體外合成的寡核苷酸文庫(kù)中利用指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(SELEX)篩選得到的單鏈核苷酸分子（RNA或ssDNA），通過(guò)折疊形成高級(jí)結(jié)構(gòu)，與特定靶標(biāo)高效結(jié)合影響其生物學(xué)功能。核酸適配體以高親和力、高特異性、易修飾、可大量合成、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定等優(yōu)勢(shì)，在毒素、腫瘤細(xì)胞、致病菌和病毒等診斷技術(shù)研究中應(yīng)用廣泛。因此，核酸適配體作為單克隆抗體的有益補(bǔ)充，可為獸醫(yī)病原微生物研究提供新思路和新工具。

3、>　　本研究采用磁珠SELEX技術(shù)篩選了AMDV VP2蛋白的核酸適配體。經(jīng)過(guò)10輪篩選，獲得與靶蛋白具有明顯親和力的富集文庫(kù)。通過(guò)高通量測(cè)序、同源性比對(duì)和進(jìn)化樹(shù)分析，共得到4個(gè)不同分支，分別選取候選核酸適配體(AMDV-1＃、AMDV-11＃、AMDV-14＃和AMDV-18＃)進(jìn)行特性分析。ELOSA試驗(yàn)結(jié)果顯示AMDV-1＃和AMDV-14＃與靶蛋白具有良好的親和力(Kd=565nM和Kd=247nM)和特異性(P＜001)。通過(guò)

4、比較AMDV-1＃和AMDV-14＃適配體的高級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，兩者存在共同序列“CCTATGCGTGCTACCGTG”，且該序列參與形成典型的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)可能與適配體的特性直接相關(guān)。
　　為了開(kāi)發(fā)核酸適配體在AMDV檢測(cè)上的應(yīng)用價(jià)值，本研究建立了核酸適配體和單克隆抗體聯(lián)合應(yīng)用的雙夾心ELOSA方法。通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)條件，確定單克隆抗體的最佳工作濃度為10ng/μL，適配體濃度為1μM，該方法與犬細(xì)小病毒、犬腺病毒及BSA蛋白均無(wú)交叉反

5、應(yīng)，檢測(cè)限度為50ng/μL，通過(guò)檢測(cè)53份水貂糞便臨床樣品，該方法與PCR檢測(cè)的總符合率為8966％。為了篩選得到具有抑制病毒復(fù)制的核酸適配體，本研究首先建立了AMDV-Utah株在CRFK細(xì)胞上的感染體系，MTT試驗(yàn)結(jié)果表明不同濃度適配體對(duì)細(xì)胞活性沒(méi)有產(chǎn)生明顯影響(P＞005)。根據(jù)富集文庫(kù)測(cè)序、序列進(jìn)化分析結(jié)果，挑選15條序列開(kāi)展抗病毒活性研究。結(jié)果表明，AMDV-12?？山档透腥倔w系中約22％的病毒載量，而其它適配體對(duì)病毒復(fù)制的