海洋致病菌創(chuàng)傷弧菌的核酸適配體篩選，優(yōu)化與初步應(yīng)用.pdf

1、創(chuàng)傷弧菌（Vibrio vulnificus）是菌體短小，直桿狀或彎曲弧狀的革蘭陰性弧菌屬細(xì)菌，兼性厭氧，具有嗜鹽性。創(chuàng)傷弧菌是常見的海洋致病菌，常常寄生于軟體動物和貝殼動物，可通過進食染毒食物或傷口接觸感染，病例多發(fā)生于臨海的國家和地區(qū)。創(chuàng)傷弧菌感染致死率高，引發(fā)的死亡占弧菌感染致死人數(shù)的82％。創(chuàng)傷弧菌的感染發(fā)展迅速，最快接觸后4小時即可出現(xiàn)癥狀，如果3天內(nèi)沒有得到抗生素治療，死亡率可達(dá)100％。中國現(xiàn)行的創(chuàng)傷弧菌檢測方法基于增菌培

2、養(yǎng)，一般需要2-3天才能得到精確到種的結(jié)果。顯然，基于培養(yǎng)的檢測手段無法滿足快速檢測創(chuàng)傷弧菌的需求。因此發(fā)展一種快速、準(zhǔn)確的新檢測方法用于創(chuàng)傷弧菌的臨床診斷和食品安全監(jiān)控迫在眉睫。
　　近年來，研究者們開始嘗試將核酸適配體應(yīng)用于微生物檢驗檢測領(lǐng)域。開發(fā)了許多基于核酸適配體的生物傳感器平臺，在分析診斷、食品安全等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。核酸適配體是單鏈的DNA或RNA，核苷酸單鏈構(gòu)象的多態(tài)性意味著即使長度一致的核苷酸鏈也會具有不同的三級結(jié)

3、構(gòu)，因此適配體也被稱為化學(xué)抗體。利用這一特性，通過SELEX(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)技術(shù)，將長度相同，序列隨機排布的ssDNA或ssRNA文庫與靶細(xì)菌孵育，不斷富集、篩選和擴增與靶細(xì)菌結(jié)合的序列，即可篩選得到與靶標(biāo)微生物特異性結(jié)合的核酸適配體。適配體可以批量合成，添加各種化學(xué)基團修飾，與阻抗生物傳感器、流式細(xì)胞儀、膠體金檢測儀等生物傳感器聯(lián)用，

4、實現(xiàn)微生物的鑒別診斷。
　　本研究通過以菌體為靶標(biāo)的SELEX技術(shù)篩選，獲得兩條與創(chuàng)傷弧菌特異性結(jié)合的核酸適配體，V8和V13。兩條核酸適配體的親和力均達(dá)到nM級別，去除引物區(qū)后，核酸適配體的隨機區(qū)域依舊保持了它們的高特異性和高親和力，在實際應(yīng)用中更短的核苷酸序列也意味著更低的生產(chǎn)成本。核酸適配體可以與處于不同生長狀態(tài)的創(chuàng)傷弧菌結(jié)合:對數(shù)生長早期、對數(shù)生長晚期、靜止期和活的非可培養(yǎng)狀態(tài)下的創(chuàng)傷弧菌與核酸適配體孵育后均顯示了相似的熒

5、光信號。激光共聚焦顯微鏡觀察可以發(fā)現(xiàn)，與其他種屬的細(xì)菌共同孵育，核酸適配體可以特異性地識別出創(chuàng)傷弧菌。此外，在處理過的血漿中和牡蠣浸出液中，V8依然能夠保持構(gòu)象穩(wěn)定，與創(chuàng)傷弧菌結(jié)合不受影響。核酸適配體不僅可以檢出創(chuàng)傷弧菌菌株ATCC27562，也可以檢出其他來源分離得到的創(chuàng)傷弧菌菌株。
　　驗證了流式細(xì)胞儀聯(lián)合核酸適配體V8直接對液體樣本進行創(chuàng)傷弧菌檢測的可行性。該檢測方法檢測性能良好，理論檢測限為:29.7CFU/mL，可靠檢測

6、限為100CFU/mL。線性范圍為:500-500，000CFU/mL。用蛋白酶K作用創(chuàng)傷弧菌20min可得到細(xì)菌碎片，與核酸適配體V8結(jié)合后，熒光信號值比正常創(chuàng)傷弧菌高3倍，理論檢測限降至7.804CFU/mL，可靠檢測限為28CFU/mL。整個檢測過程縮短至1h以內(nèi)，與基于培養(yǎng)的檢測方法相比顯著降低。
　　綜上，通過以菌體為靶標(biāo)的SELEX技術(shù)，篩選到了特異性強，高親和力的創(chuàng)傷弧菌核酸適配體。核酸適配體與流式細(xì)胞技術(shù)結(jié)合，不但