貂阿留申病病毒流行毒株分子特征及其VP2基因重組桿狀病毒免疫特性研究.pdf

1、貂阿留申病病毒(Aleutian Mink Disease virus，ADV)屬細(xì)小病毒科阿留申病毒屬成員，可以引起水貂慢性進(jìn)行性疾病，即水貂阿留申病(Aleutian disease of mink，AD)，以繁殖能力下降、貂體消瘦、自身免疫病、高免疫球蛋白血癥、細(xì)菌感染的易感性增加、腎衰竭死亡為基本特征。目前，該病普遍存在于世界各地人工養(yǎng)殖的水貂種群中，給養(yǎng)貂業(yè)造成了極其嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。中國黑龍江、吉林、遼寧、山東、新疆和內(nèi)蒙古等

2、省貂場也存在該病，血清抗體陽性率20％～30％。本研究從中國不同地區(qū)臨床發(fā)病水貂分離鑒定獲得3株ADV流行毒株，完成分離毒株編碼區(qū)基因序列分析，建立成功該病毒TaqMan實時PCR和間接ELISA抗體檢測方法，用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)該病毒VP2結(jié)構(gòu)蛋白，闡明其免疫特性，為該病防控奠定了重要基礎(chǔ)。具體研究內(nèi)容分為以下5個部分:
　　 1.貂阿留申病病毒分離與鑒定
　　 用對流免疫電泳(CIEP)方法對國內(nèi)主要的水貂養(yǎng)殖

3、地區(qū)（山東、遼寧、黑龍江）疑似感染ADV癥狀的水貂進(jìn)行ADV血清抗體檢測，選擇抗體陽性貂進(jìn)行撲殺，剖檢，無菌采取肝、脾、腎、腸系膜淋巴結(jié)樣品，電鏡觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)小病毒樣顆粒。將研磨組織液過濾后加雙抗，接種CRFK細(xì)胞，分離病毒，盲傳6代，取細(xì)胞培養(yǎng)病毒液用PCR方法檢測，證明分離獲得3株ADV。將3株分離病毒接種健康水貂，隔離觀察，接種后3天出現(xiàn)食欲減退，貧血，被毛無光澤，后期出現(xiàn)拒食、狂飲，死亡，個別貂具有神經(jīng)癥狀，表現(xiàn)抽搐、痙攣、步態(tài)蹣

4、跚，共濟(jì)失調(diào)或后肢麻痹等癥狀，證明分離獲得3株ADV，分別命名為ADV-LN1、ADV-LN2、ADV-LN3。
　　 2.貂阿留申病病毒分離株基因測定與分析
　　 采用PCR技術(shù)對ADV-LN1、ADV-LN2和ADV-LN3分離株進(jìn)行編碼區(qū)基因擴(kuò)增、克隆和測序分析，結(jié)果獲得完整編碼區(qū)基因序列，長度為4543bp、4566bp和4566bp?；蛐蛄蟹治鼋Y(jié)果顯示，ADV-LN1、ADV-LN2、ADV-LN3與歐美毒株

5、ADV-G、ADV-Utah1、ADV-SL3相比核苷酸最高同源性結(jié)構(gòu)蛋白VP1為97.4％，非結(jié)構(gòu)蛋白最高同源性NS1、NS2、NS3分別為92.6％、93.3％、93.9％。推導(dǎo)的氨基酸最高同源性VP1為97.2％，NS1、NS2、NS3分別為89.2％、91.2％、92.0％。VP1基因長2064bp，編碼688個氨基酸，與細(xì)小病毒屬中PPV-Nanjing200801相似性最大(51.2％)，病毒VP1遺傳進(jìn)化樹分析表明，本病毒

6、與細(xì)小病毒屬VP1親緣關(guān)系最近，中國分離毒株可能為遠(yuǎn)離歐美的新毒株或由美國ADV-Utah1毒株進(jìn)化而來。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，該蛋白是一種保守不含信號肽的外膜蛋白，具有7個潛在的N-糖基化位點和34個磷酸化位點。二級結(jié)構(gòu)分析顯示無規(guī)則卷曲含量最高，達(dá)68.75％，α螺旋、β折疊分別為16.42％和14.83％;同源建模比對，構(gòu)建了具有較高合理性和可靠性的三維空間結(jié)構(gòu);預(yù)測抗原表位主要位于肽鏈第254～265、96～112、317～3

7、48、514～523、629～645位區(qū)段。
　　 3.貂阿留申病病毒TaqMan實時PCR檢測方法的建立與應(yīng)用
　　 根據(jù)GenBank ADV-G毒株VP2基因的保守序列，設(shè)計合成了一套引物和TaqMan探針，在國內(nèi)首次建立了實時熒光定量PCR方法，用于檢測ADV。結(jié)果顯示，該方法具有較好的特異性和重復(fù)性，對ADV的DNA檢測下限為47.7copy/μL，敏感性比常規(guī)PCR高106倍。分別用該法和普通PCR方法對遼寧

8、、山東規(guī)模化水貂養(yǎng)殖場60份有阿留申病臨床癥狀的水貂組織病料樣品進(jìn)行ADV檢測，結(jié)果兩種方法符合率為95％，表明該方法具有更快速、靈敏、準(zhǔn)確、低污染等優(yōu)點，為我國進(jìn)口水貂檢驗檢疫及國內(nèi)水貂養(yǎng)殖場針對ADV診斷提供了快速檢測方法。
　　 4.貂阿留申病病毒VP2主要功能區(qū)原核表達(dá)與間接ELISA抗體檢測方法的建立
　　 本研究利用PCR技術(shù)擴(kuò)增ADV VP2基因片段，其長度為950bp，克隆至pET-28a(+)原核表達(dá)載

9、體，構(gòu)建獲得重組載體pET-28a(+)-VP2，經(jīng)酶切、PCR擴(kuò)增和測序分析確證目的基因閱讀框正確。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至宿主菌BL21(DE3)，用異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE電泳結(jié)果證明該表達(dá)產(chǎn)物分子質(zhì)量約為42kD，與理論推測的蛋白分子質(zhì)量一致，經(jīng)Western-blot分析證明，該重組蛋白可被ADV陽性血清所識別。采用純化的VP2蛋白為包被抗原，成功建立間接ELISA抗體檢測方法，通過比較試驗

10、、特異性試驗、阻斷試驗和重復(fù)性試驗，表明該方法具有較高特異性和靈敏度，重復(fù)性較好。用建立的ELISA方法和對流免疫電泳同時檢測120份血清樣品，兩者符合率為95.8％，證明該方法可用于ADV抗體檢測。
　　 5.阿留申病病毒VP2基因重組桿狀病毒的構(gòu)建與免疫特性研究
　　 將阿留申病病毒ADV-LN2株VP2基因克隆到載體pFastBacTMDual中，構(gòu)建重組轉(zhuǎn)座栽體pFBD-VP2，然后將其轉(zhuǎn)化DH10Bac感受態(tài)大

11、腸桿菌，將VP2基因整合到Bacmid穿梭栽體中，獲得重組穿梭載體BacmidVP2;通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染將其轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞，獲得重組桿狀病毒rBacVP2。用Western blot和間接免疫熒光試驗分析表明ADV VP2蛋白在Sf9昆蟲細(xì)胞獲得正確表達(dá)，所表達(dá)的重組VP2蛋白分子量約35kD。將重組VP2蛋白加入弗氏不完全佐劑，免疫BABL/c鼠，同時采用ADV-LN2病毒滅活佐劑苗、野生型桿狀病毒佐劑苗和不免疫為陰性對照，兩次免疫，