乙肝病毒核心抗原二聚體形成相關(guān)氨基酸序列鑒定.pdf

1、目的：
　　乙肝病毒核心顆粒的基本構(gòu)成單位是核心蛋白（HBc）二聚體，與二聚體形成相關(guān)的核心蛋白一級結(jié)構(gòu)尚未被充分鑒定，造成該現(xiàn)狀的一個重要原因，是缺乏一種簡便有效的表征HBc二聚體形成的方法，本研究的目的，是建立一種可用于反映HBc二聚體形成的新方法，并用該方法來鑒定與乙肝病毒核心蛋白（HBc）二聚體形成相關(guān)的重要氨基酸序列。
　　方法：
　　我們首先構(gòu)建了一種可反映乙肝病毒核心蛋白二聚體形成新方法，該方法主要基于分

2、段的海腎熒光素酶（Rluc）互補(bǔ)原理。將Rluc基因分為N（1-229aa），C（229-311aa）兩段，分別與核心蛋白基因通過長片段接頭融合，當(dāng)HBc二聚體形成時，這兩段可通過互補(bǔ)部分恢復(fù)熒光素酶活性，因而該酶活性可以間接反映二聚體的形成情況。然后，我們構(gòu)建一系列乙肝病毒核心蛋白缺失突變體，以鑒定對HBc二聚體形成較為重要的氨基酸序列。最后，在3xFlag-HBC系統(tǒng)上對某些缺失突變體是否能形成capsid進(jìn)行了研究。
　　結(jié)

3、果：
　　1.利用Golden gate克隆方法，成功構(gòu)建了一系列質(zhì)粒，包括過渡載體質(zhì)粒GG1，質(zhì)粒RlucN-HBc，RlucC-HBc，陰性對照質(zhì)粒RlucN-dHBc和RlucC-dHBc，突變質(zhì)粒RlucN-HBc127Q，RlucC-HBc127Q，RlucN-HBc132A，RlucC-HBc132A，RlucN-HBc42A，RlucC-HBc42A，RlucN-HBc23A，RlucC-HBc23A；
　　2

4、.轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)表明，RlucN-HBc與RlucC-HBc共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞后，與三種對照組 RlucC-dHBC+RlucN-dHBC，RlucC-HBC+RlucN-dHBC，RlucC-dHBC+RlucN-HBC相比，RlucC-HBC+RlucN-HBC所產(chǎn)生的熒光素酶活性高出25倍以上；
　　3.各種核衣殼形成缺陷型突變體，包括RlucN-HBC127Q+RlucC-HBC127Q，RlucN-HBC23A+ Rluc

5、C-HBC23A，以及RlucN-HBC42A+RlucC-HBC42A共轉(zhuǎn)染，產(chǎn)生的光信號與野生型RlucN-HBC+RlucC-HBC相比，均沒有顯著降低；
　　4.成功構(gòu)建了覆蓋HBc N端，C端以及5個а螺旋區(qū)域的總共30余種缺失突變體質(zhì)粒（基于質(zhì)粒RlucC-HBc）；
　　5.以上突變體質(zhì)粒分別于RlucN-HBC共轉(zhuǎn)染后，Rluc熒光素酶活性檢測結(jié)果顯示，C端覆蓋122-183aa、N端覆蓋1-5aa的缺失突變

6、保留陽性對照50-80%的熒光素酶活性；N端覆蓋6-41aa、C端103-120aa的缺失突變體則接近陰性對照水平；覆蓋6-17、30-41、75-81、86-90、121-143的缺失突變均獲得陽性對照80%以上的熒光素酶活性，覆蓋26-29、61-65、71-75、117-120的缺失突變約為陽性對照的40%左右，而覆蓋18-25、50-60、66-70、81-85、91-116的缺失突變?yōu)殛栃詫φ盏?0%一下。
　　6.3x

7、Flag-HBCd81-85、d86-90能形成capsid，3xFlag-HBCd38-41 d50-55、d91-95、d106-110不能形成capsid。
　　結(jié)論：
　　1.成功構(gòu)建能反映乙肝病毒核心蛋白二聚體形成的分段海腎熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)；
　　2.序列50-55、91-95、106-110對乙肝病毒核心蛋白二聚體的形成是必須的；
　　3.序列18-25、56-60、66-70、96-105、111-