白細(xì)胞介素-35對(duì)小鼠活化效應(yīng)T淋巴細(xì)胞凋亡的影響及作用機(jī)制.pdf

1、目的：1.探討白細(xì)胞介素-35(interleukin-35，IL-35)對(duì)離體活化小鼠效應(yīng)T淋巴細(xì)胞凋亡的影響及其可能機(jī)制。2.觀察IL-35對(duì)離體活化小鼠效應(yīng)T淋巴細(xì)胞凋亡的時(shí)效與量效關(guān)系。3.研究B細(xì)胞淋巴瘤2蛋白(B-cell lymphoma2，Bc1-2)在IL-35誘導(dǎo)離體活化小鼠效應(yīng)T淋巴細(xì)胞凋亡中的作用。4.觀察IL-35對(duì)活化小鼠效應(yīng)T淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子包括白細(xì)胞介素-10(Interleukin-10，IL-10

2、)、轉(zhuǎn)化因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)、白細(xì)胞介素-4(Interleukin-4，IL-4)、干擾素γ(Interferon-γ，，IFN-γ)的影響。
　　方法：體外分離培養(yǎng)小鼠CD4+T淋巴細(xì)胞，在含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/ml，其后培養(yǎng)于12孔培養(yǎng)板；采用不同濃度的IL-35(2、10、50ng/ml)于不同時(shí)間點(diǎn)(12h、24h、4

3、8h)予以刺激，同時(shí)給予刀豆素A(concanavalin A，ConA)1μg/ml輔助活化。實(shí)驗(yàn)一：應(yīng)用IL-35刺激后，AnnexinV-FITC法檢測(cè)小鼠CD4+T淋巴細(xì)胞凋亡，分析時(shí)間/劑量效應(yīng)關(guān)系。實(shí)驗(yàn)二：采用RT-PCR法及Western Blot法檢測(cè)小鼠CD4+T淋巴細(xì)胞在IL-35刺激后，Bc1-2mRNA表達(dá)與蛋白水平的變化，籍以了解Bc1-2在IL-35誘導(dǎo)CD4+T淋巴細(xì)胞凋亡中的可能作用。實(shí)驗(yàn)三：采用不同劑量

4、IL-35刺激小鼠活化CD4+T淋巴細(xì)胞24h后收集上清，ELISA法檢測(cè)細(xì)胞因子IL-10、IL-4、TGF-β、IFN-γ水平的變化。
　　結(jié)果：1.IL-35對(duì)小鼠活化CD4+T淋巴細(xì)胞凋亡的影響：當(dāng)IL-35刺激劑量達(dá)到10ng/ml及50ng/ml時(shí)，與對(duì)照組相比，在作用24h和48h均觀察到了明顯的凋亡現(xiàn)象的發(fā)生(P<0.01)，而2ng/mlIL-35組與對(duì)照組無(wú)明顯差別。10ng/mlIL-35誘導(dǎo)CC4+T淋巴細(xì)

5、胞24h即可發(fā)生凋亡(P<0.01)，在48h時(shí)凋亡效應(yīng)達(dá)到高峰(P<0.01)。而50ng/mlIL-35誘導(dǎo)CD4+T淋巴細(xì)胞24h凋亡效應(yīng)即可達(dá)峰值(P<0.01)，在48h時(shí)由于細(xì)胞死亡數(shù)目增加，凋亡率下降。2.2ng/ml、10ng/ml和50ng/mlIL-35作用于離體活化小鼠CD4+T淋巴細(xì)胞24h后，提取全細(xì)胞蛋白及RNA，利用Western Blot及RT-PCR方法檢測(cè)Bc1-2在蛋白及mRNA水平的變化。

6、　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨IL-35刺激劑量的增加，Bc1-2分子在蛋白及mRNA水平均呈現(xiàn)先升高后下降的變化趨勢(shì)(P<0.01)。3.10ng/mlIL-35和50ng/mlIL-35刺激離體活化小鼠CD4+T淋巴細(xì)胞24h后留取上清，ELISA法檢測(cè)上清液細(xì)胞因子IL-10、TGF-β、IL-4、IFN-γ的分泌情況。結(jié)果顯示：隨刺激劑量的增加，Th2類細(xì)胞因子IL-10、TGF-β表達(dá)量明顯增加(P<0.01)；IL-4各組表達(dá)量無(wú)明顯

7、差異；Th1類細(xì)胞因子IFN-γ在10ng/ml組表達(dá)量明顯下降，其余各組表達(dá)無(wú)差異。
　　結(jié)論：1.IL-35以時(shí)間/劑量依賴性誘導(dǎo)小鼠CD4+T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生凋亡效應(yīng)，在膿毒癥發(fā)病過(guò)程中，這一效應(yīng)可能是其導(dǎo)致免疫功能紊亂的重要機(jī)制。2.IL-35能夠影響B(tài)c1-2分子的表達(dá)，且效應(yīng)隨著劑量的增加而顯著增強(qiáng)。提示IL-35可能通過(guò)線粒體途徑，影響B(tài)c1-2蛋白的表達(dá)從而發(fā)揮其促凋亡效應(yīng)。3.IL-35能夠影響CD4+T淋巴細(xì)胞的分