人類多潛能干細(xì)胞體外分化紅細(xì)胞發(fā)育過程中表型分子的研究.pdf

1、目的:人類多潛能干細(xì)胞（human pluripotent stem cells，hPSCs）主要包括人胚胎干細(xì)胞(human embryonic stem cells，hESCs)和人誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞(humaninduced pluripotent stem cells，hiPSCs)，二者兼具體外自我更新、無限增殖及多分化潛能的特性。它們的成功建株，極大地推動了干細(xì)胞基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用研究。研究的一個重要方向是將hPSCs向特定

2、譜系的成熟血液細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化。
　　因?yàn)橐恢睕]有合適的研究人類早期造血發(fā)生的模型，以往的研究主要都是基于小鼠等動物模型。hESCs體外誘導(dǎo)分化紅細(xì)胞的過程，模擬了人類胚胎期體內(nèi)紅系發(fā)生發(fā)育過程，為研究紅細(xì)胞正常發(fā)育的調(diào)控機(jī)理奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。另一方面，利用患者h(yuǎn)iPSCs體系建立體外誘導(dǎo)分化紅細(xì)胞的方法，將為研究紅細(xì)胞早期發(fā)育異常相關(guān)疾病的致病機(jī)理和開發(fā)個體化治療手段提供理想的平臺。
　　在所有血細(xì)胞中，成熟紅細(xì)胞因?yàn)椴缓?xì)

3、胞核，并攜帶著最小量的遺傳物質(zhì)，壽命較長等特點(diǎn)，有望作為最早的干細(xì)胞來源的細(xì)胞治療產(chǎn)品而應(yīng)用于臨床。但在成功實(shí)現(xiàn)hPSC來源的紅細(xì)胞臨床應(yīng)用前，還存在諸多問題需解決，例如:培養(yǎng)體系的不健全導(dǎo)致的體外擴(kuò)增效率低、成熟程度低;脫核調(diào)控機(jī)制不明;沒有合適的活體移植模型等。這些困難需要通過對hPSC來源紅細(xì)胞的發(fā)生和成熟過程中的關(guān)鍵調(diào)控機(jī)理的理解來攻克。
　　為了精密地研究hPSCs體外誘導(dǎo)分化紅細(xì)胞的發(fā)育過程，在方法學(xué)上有兩個亟待解決的

4、問題。(1)現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)已顯示不同誘導(dǎo)體系產(chǎn)生的紅細(xì)胞成熟程度有差異。這種差異指向一個事實(shí)，即成體造血微環(huán)境來源的基質(zhì)細(xì)胞的誘導(dǎo)對hPSCs產(chǎn)生成熟紅細(xì)胞是必需的。所以需要建立一套高效并趨于自然的共培養(yǎng)方法，以得到類似于自然發(fā)育過程產(chǎn)生的成熟紅細(xì)胞。(2) hPSC來源的紅細(xì)胞分化培養(yǎng)體系中，同時存在原始造血及成體造血過程，并且紅細(xì)胞在早期發(fā)育存在不同的發(fā)育階段。為了辨別不同的細(xì)胞，需要建立一種快捷、方便且準(zhǔn)確的標(biāo)識方法。在成體干細(xì)胞向

5、紅細(xì)胞分化發(fā)育過程的研究領(lǐng)域，已成功利用表型分子來區(qū)分紅細(xì)胞的不同發(fā)育階段，啟示我們也可能利用表型分子來區(qū)分hPSC來源紅細(xì)胞的早期不同發(fā)育階段。
　　方法:我們比較了不同的成體造血微環(huán)境來源的基質(zhì)細(xì)胞，選擇了小鼠主動脈-性腺-中腎（Aorta-Gonad-Mesonephros，AGM）細(xì)胞作為共培養(yǎng)體系的基質(zhì)細(xì)胞。AGM區(qū)域是最早的支持成體造血的位點(diǎn)。我們建立了將hPSCs與AGM來源的細(xì)胞系A(chǔ)GM-S3體外向紅細(xì)胞分化的培養(yǎng)

6、方法。首先將hPSCs細(xì)胞與AGM-S3細(xì)胞系先共培養(yǎng)誘導(dǎo)造血分化的發(fā)生，再經(jīng)懸浮培養(yǎng)向紅細(xì)胞定向分化并擴(kuò)增。以成體干細(xì)胞hCB-CD34+來源的紅細(xì)胞為對照，用先進(jìn)的多色流式分析技術(shù)，探索hPSCs與AGM-S3共培養(yǎng)來源紅細(xì)胞特異的表型分子表達(dá)譜系。隨后以分別表達(dá)特異表型分子的紅細(xì)胞亞群GPA+CD36-和GPA+CD34+為切入點(diǎn)，利用熒光激活細(xì)胞分選(Fluorescence Activated Cell Sorting，F(xiàn)AC

7、S)技術(shù)，精確地將各目標(biāo)細(xì)胞亞群分選出。然后利用瑞姬氏(May-Grunwald-Giemsa，MGG)染色方法觀察細(xì)胞形態(tài)，通過免疫熒光染色方法考察血紅蛋白組分來評價紅細(xì)胞的成熟程度，并采用qRT-PCR技術(shù)檢測造血及紅細(xì)胞發(fā)育相關(guān)的重要基因的轉(zhuǎn)錄水平。
　　結(jié)果與結(jié)論:我們建立了高效的hPSC/AGM-S3共培養(yǎng)造血誘導(dǎo)分化體系，可以產(chǎn)生大量的高純度和高成熟度紅細(xì)胞，共培養(yǎng)12天再懸浮培養(yǎng)24天時，紅細(xì)胞數(shù)量約為起始未分化H1

8、細(xì)胞數(shù)量的300倍，其中85％以上表達(dá)成體型血紅蛋白β。hPSC/AGM-S3共培養(yǎng)體系來源的紅細(xì)胞β血紅蛋白的表達(dá)率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他實(shí)驗(yàn)室報道的數(shù)據(jù)。
　　我們在這個高效體系上進(jìn)一步研究了hPSC/AGM-S3共培養(yǎng)體系來源紅細(xì)胞發(fā)育過程的表型分子表達(dá)譜系，發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)階段紅系特有的表型分子GPA陽性(GPA+)細(xì)胞上的其他共表達(dá)表型分子模式與已知的成體型紅細(xì)胞的發(fā)育模式不同。其中GPA和成熟紅細(xì)胞的特定分子CD36和造血干細(xì)胞的特有

9、分子CD34的共表達(dá)均存在hPSCs分化發(fā)育的特有模式。我們根據(jù)這兩條線索，進(jìn)行了進(jìn)一步細(xì)致地研究工作。
　　本工作通過精密細(xì)致地研究，首次發(fā)現(xiàn)并論證了hPSC來源的早期紅細(xì)胞可根據(jù)GPA和CD36抗原的共表達(dá)的表達(dá)變化指示不同的發(fā)育階段。在共培養(yǎng)階段相當(dāng)長一段時間（6-18天）紅細(xì)胞表型為GPA+CD36-，懸浮培養(yǎng)后逐漸變?yōu)镚PA+CD36low/+，10+5天時達(dá)到一半左右，然后又再逐漸變?yōu)镚PA+CD36-。我們在不同時間

10、點(diǎn)將CD36表達(dá)不同的紅細(xì)胞亞群利用流式分選技術(shù)分離出來，通過對特定紅細(xì)胞亞群Hb組分、表型分子及基因轉(zhuǎn)錄相對水平的比較，進(jìn)一步揭示了這一系列的表型變化過程同時伴隨著中胚層及內(nèi)皮細(xì)胞特性的丟失，原始造血向成體造血特性的轉(zhuǎn)變以及紅細(xì)胞成熟度逐漸升高等變化過程。綜合我們的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，提示紅細(xì)胞的初期發(fā)育是源于中胚層向內(nèi)皮造血的途徑，遠(yuǎn)在成體造血干/祖細(xì)胞被確定誕生之前。
　　進(jìn)一步的研究還發(fā)現(xiàn)hPSC/AGM-S3共培養(yǎng)階段紅細(xì)胞最初存