誘導(dǎo)大鼠晶狀體上皮細(xì)胞去分化生成誘導(dǎo)多潛能干細(xì)胞的初步研究.pdf

1、第一章大鼠晶狀體上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)
　　目的:建立一種簡單快速有效的體外培養(yǎng)大鼠晶狀體上皮細(xì)胞的方法，進(jìn)一步認(rèn)識其生長、分化規(guī)律。
　　方法:取初生3-5天SD大鼠，在無菌環(huán)境下撕取其晶狀體前囊膜和赤道周邊部囊膜，采用胰酶消化法培養(yǎng)。在顯微鏡下觀察細(xì)胞生長規(guī)律及形態(tài)學(xué)特征;免疫熒光化學(xué)法對晶狀體上皮細(xì)胞進(jìn)行鑒定及分析其純度;MTT法分析各代細(xì)胞的生長速率及細(xì)胞的生長曲線。
　　結(jié)果:酶消化法培養(yǎng)的大鼠晶狀體上皮細(xì)胞生長

2、迅速，呈扁平不規(guī)則多邊形，鑲嵌狀排列;第二代細(xì)胞開始細(xì)胞呈單層貼壁生長，分布均勻;從第四代細(xì)胞開始出現(xiàn)纖維化的趨勢，細(xì)胞形態(tài)呈梭形成纖維細(xì)胞樣;第六代細(xì)胞開始出現(xiàn)老化。從第一代細(xì)胞到第十代細(xì)胞幾乎100％表達(dá)αA-crystallin，從第五代細(xì)胞開始胞漿內(nèi)αA-crystallin表達(dá)量下降;第四代第五代細(xì)胞生長速率最大，第三代細(xì)胞次之;第三代細(xì)胞在培養(yǎng)約24h后達(dá)到對數(shù)期。
　　結(jié)論:酶學(xué)消化法是一種高效、實用、簡便的晶狀體上

3、皮細(xì)胞原代培養(yǎng)方法，第3代大鼠晶狀體上皮細(xì)胞是進(jìn)行細(xì)胞學(xué)及相關(guān)研究理想的實驗對象。
　　第二章原代培養(yǎng)的大鼠晶狀體上皮細(xì)胞誘導(dǎo)去分化生成誘導(dǎo)多潛能干細(xì)胞的初步研究
　　目的:將第三代大鼠晶狀體上皮細(xì)胞在生長對數(shù)期導(dǎo)入Oct4、c-Myc、Sox2、Klf4四個具有多能性的轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)去分化為誘導(dǎo)多潛能干細(xì)胞。
　　方法:用攜帶四個具有多能性的轉(zhuǎn)錄因子的仙臺病毒對處于對數(shù)期生長的原代培養(yǎng)的晶狀體上皮細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)去分化，轉(zhuǎn)

4、染后的第七天移植至飼養(yǎng)層細(xì)胞上，顯微鏡下觀察胚胎干細(xì)胞樣克隆團(tuán)塊的形成以及其生成的效率。將生成的胚胎干細(xì)胞樣克隆團(tuán)塊進(jìn)行免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色鑒定胚胎干細(xì)胞標(biāo)志性蛋白SSEA-1、OCT4的表達(dá)，以及qRT-PCR鑒定胚胎干細(xì)胞標(biāo)志性基因NANOG、REX1、OCT4的表達(dá)。
　　結(jié)果:誘導(dǎo)后的晶狀體上皮細(xì)胞可生成RLEC-ES樣細(xì)胞克隆團(tuán)塊，轉(zhuǎn)染效率為0.034％±0.0092％，取RLEC-ES樣細(xì)胞克隆團(tuán)塊進(jìn)行胚胎干細(xì)胞標(biāo)志性