誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞肝細(xì)胞定向分化及移植的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景：
　　 2006年科學(xué)家發(fā)現(xiàn)可以通過轉(zhuǎn)導(dǎo)4個基因?qū)⑿∈蟮钠つw細(xì)胞重編碼為具有胚胎干細(xì)胞功能的干細(xì)胞，他們將這種細(xì)胞命名為誘導(dǎo)型多潛能干細(xì)胞(Induced Pluripotent stem Cells，iPS cells)。2009年中國科學(xué)家證實(shí)將iPS細(xì)胞植入四倍體囊胚，可以發(fā)育成小鼠活體，充分證明了iPS同胚胎干細(xì)胞功能上對等具有多能性(Pluripotent)，是一種全新的多潛能干細(xì)胞。iPS細(xì)胞同胚胎干細(xì)胞相

2、似具有2大特點(diǎn)：即在體外能夠無限自我更新和多能性(在適宜的條件下能夠分化為機(jī)體3個胚層的所有細(xì)胞)，能夠?yàn)槿斯じ?，肝臟細(xì)胞移植和肝臟組織工程提供種子細(xì)胞。iPS細(xì)胞不需要破壞胚胎沒有倫理壓力和同時這些多潛能性干細(xì)胞來自病人本身沒有HLA不匹配的問題，不存在免疫排斥的問題，所以iPS細(xì)胞是臨床肝細(xì)胞非常理想的來源，使得肝病個體化研究和治療有望成為現(xiàn)實(shí)。但是iPS細(xì)胞本身不具備肝細(xì)胞的功能，而且如果直接注入機(jī)體會產(chǎn)生畸胎瘤，在應(yīng)用于治療之前

3、必需先將其分化為功能性細(xì)胞。所以探討如何在體外使iPS細(xì)胞遵循正常肝臟胚胎發(fā)育通路定向分化為肝細(xì)胞是一項(xiàng)重要的工作。
　　 目的：
　　 探討如何誘導(dǎo)小鼠iPS細(xì)胞遵循肝臟發(fā)育途徑分化為具有合成、代謝、分泌及儲存功能的肝細(xì)胞并探討iPS來源確定性內(nèi)胚層細(xì)胞(Definitive Endoderm，DE)和肝細(xì)胞體內(nèi)移植可行性、效果和生物安全性。
　　 方法：
　　 1.設(shè)計全新的2步誘導(dǎo)法，首先iPS細(xì)胞

4、誘導(dǎo)分化為ADE，再繼續(xù)誘導(dǎo)分化為肝細(xì)胞。第一步在單層和無血清的培養(yǎng)條件下，分2個階段序貫加入活化素A(ActinvinA)，骨形態(tài)蛋白4(BMP4)，基本纖維細(xì)胞生長因子(Basic fibroblastgrowth factor，bFGF)，表皮生長因子(Epidermal growth factor，EGF)，序貫激活和協(xié)調(diào)Nodal信號和FGF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，促使iPS細(xì)胞誘導(dǎo)分化為DE細(xì)胞。
　　 2.第二步在建立DE細(xì)

5、胞的基礎(chǔ)上再次分2個階段先加入BMP4和肝細(xì)胞生長因子(Hepatocyte growth factor，HGF)，誘導(dǎo)DE細(xì)胞向肝細(xì)胞方向分化，在使用肝細(xì)胞專用培養(yǎng)基，加入HGF，腫瘤抑制因子(Oncostatin M,OSM)等生長因子使分化的IPS細(xì)胞進(jìn)一步分化為成熟的肝細(xì)胞。3.應(yīng)用Realtime RT-PCR細(xì)胞免疫熒光和流式細(xì)胞儀等方法從細(xì)胞形態(tài)，各階段特色基因mRNA，各階段特異性蛋白表達(dá)和各種肝細(xì)胞特異性功能檢測4個層

6、次對IPS來源的DE細(xì)胞和肝細(xì)胞進(jìn)行鑒定。4.在建立小鼠肝急性肝損傷模型的基礎(chǔ)上，采用性別差異性細(xì)胞移植，將雄性iPS來源ADE細(xì)胞和雄性iPS來源肝細(xì)胞通過門靜脈移植到受損的肝臟，來觀察這些分化的細(xì)胞能否在體內(nèi)繼續(xù)向肝臟細(xì)胞分化或維持肝細(xì)胞表型，同時評估iPS細(xì)胞治療的生物安全性。
　　 結(jié)果：
　　 1.iPS細(xì)胞在分化的第6天，形態(tài)上由典型的iPS細(xì)胞克隆即細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞之間界限不清逐步轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞排列松散，細(xì)胞

7、之間界限分明并呈現(xiàn)內(nèi)皮樣細(xì)胞狀態(tài)；在mRNA水平，分化的過程中多潛能性基因如OCT4，Nanog表達(dá)逐漸下調(diào)，而DE特色基因如CXCR4，E-Cadherin,Sox17,FoxA2表達(dá)逐漸升高；同基因表達(dá)結(jié)果一致，在蛋白水平免疫熒光顯示在分化的第6天，DE標(biāo)志性轉(zhuǎn)錄因子Sox17和FoxA2明顯高表達(dá)，同時90％的Sox17的陽性細(xì)胞同時表達(dá)FoxA2，流式細(xì)胞儀的檢測提示在分化的第6天，DE細(xì)胞表面標(biāo)記CXCR4表達(dá)可達(dá)85％，同時

8、CXCR4+C-Kit或CXCR4+E-Cadherin雙陽性細(xì)胞在分化的第6天達(dá)到約80％。2.在分化的第20天，分化細(xì)胞呈現(xiàn)多角形內(nèi)皮細(xì)胞樣形態(tài)，胞漿里出現(xiàn)糖原顆粒等肝細(xì)胞特色形態(tài)；分化的各時間段實(shí)時定量RT-PCR檢測顯示：在mRNA表達(dá)的水平，IPS細(xì)胞經(jīng)歷了肝細(xì)胞在體內(nèi)從胚胎干細(xì)胞的發(fā)育過程，而早期肝細(xì)胞特異性mRNA表達(dá)如HNF4和AFP在分化的中期開始升高，肝細(xì)胞成熟特異性RNA如Albumin,TAT,CYP7Al,CF

9、Ⅶ和Asgpr-1在分化的晚期才達(dá)高峰，同時AFP基因的表達(dá)較中期明顯下調(diào)。同mRNA表達(dá)一致，在分化的第20天，免疫熒光實(shí)驗(yàn)提示大部分的肝臟細(xì)胞表達(dá)AFP，Albumin(陽性率80％)；流式細(xì)胞儀檢測提示成熟肝細(xì)胞表面標(biāo)志唾液酸糖蛋白受體(Asialoglycoproteinreceptor-1,Asgpr-1)(陽性率42.7％)。更為重要的是這些iPS來源肝細(xì)胞在體外具有典型成熟肝細(xì)胞的功能，能夠攝取LDL,具備攝取和排出ICG

10、能力，可以儲存糖原，并能夠分泌AFP，Albumin等蛋白和尿素。尤為重要的是這些iPS來源的肝細(xì)胞樣細(xì)胞具有藥物代謝酶細(xì)胞色素P450酶的活性。3.在移植DE細(xì)胞后的1周在雌性受體的肝臟內(nèi)發(fā)現(xiàn)了Y染色體陽性細(xì)胞，這些細(xì)胞呈條索狀，較移植后的第一天明顯增生，同時大部分的Y染色體陽性的表達(dá)肝細(xì)胞特異性蛋白CYP2D6，提示這些D E細(xì)胞能夠在體內(nèi)繼續(xù)分化為肝細(xì)胞。同時在iPS細(xì)胞來源的肝細(xì)胞移植后的1周我們同樣發(fā)現(xiàn)了較大量的條索狀Y染色體

11、陽性細(xì)胞，大部分的細(xì)胞同時表達(dá)肝細(xì)胞特異性蛋白CYP2D6，提示本研究產(chǎn)生的iPS來源性肝細(xì)胞能夠在受損的肝臟內(nèi)存活并保持肝細(xì)胞的表型。然而在移植D E細(xì)胞的第6周我們發(fā)現(xiàn)受體的肝臟中出現(xiàn)了畸胎瘤。
　　 結(jié)論：
　　 1.iPS細(xì)胞能夠在無血清單層培養(yǎng)的條件下，遵循體內(nèi)肝臟胚胎早期發(fā)育的途徑，定向分化為DE細(xì)胞。2.DE細(xì)胞能夠進(jìn)一步遵循肝臟發(fā)育的路徑定向分化為肝細(xì)胞，具備具有合成、代謝、分泌及儲存功能，并有藥物代謝酶