Tenascin-c在椎間盤退行性病變的作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　本研究通過觀察Tenascin-c在椎間盤退行性病變(disc degeneration disease)的表達(dá)變化，研究Tenascin-c對椎間盤退行性病變的作用及調(diào)節(jié)Tenascin-c的表達(dá)是否對椎間盤退行性病變起到保護(hù)作用。
　　方法：
　　一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞
　　實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為Balb-c小白鼠，雌性，36只，8-12周齡。將36只小白鼠隨機(jī)分為兩組，手術(shù)組，sham組，每組各18只(n=18

2、)。各組再根據(jù)收集樣品的時(shí)間點(diǎn)分為三個(gè)亞組，即1，3，7天三個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)6只(n=6)。
　　實(shí)驗(yàn)細(xì)胞為人的椎間盤細(xì)胞和小鼠的椎間盤細(xì)胞，從人和小鼠的椎間盤分離培養(yǎng)。
　　二、實(shí)驗(yàn)方法
　　體外實(shí)驗(yàn):分離及培養(yǎng)人和小鼠的椎間盤細(xì)胞，體外培養(yǎng)至足夠細(xì)胞量。使用IL-1β(10ng/ml)給予炎性刺激4小時(shí)，8小時(shí)，12小時(shí)，24小時(shí)及48小時(shí)，通過RT-PCR來檢測在基因水平上Tenascin-c，Collage

3、nⅡ，Aggrecan的變化，通過western blot來檢測在蛋白水平上Tenascin-c的變化，通過zymography及MMPactivity assay來觀察MMP活性的變化。從而研究Tenascin-c的表達(dá)，及與collagenⅡ，aggrecan，MMP表達(dá)的關(guān)系。
　　加入外源性的Tenascin-c后，給予相同的IL-1β(10ng/ml)炎性刺激，通過RT-PCR來檢測Tenascin-c mRNA水平的變

4、化，觀察與collagenⅡ，aggrecan，MMP表達(dá)的關(guān)系;通過zymography，來觀察MMP的變化。從而研究加入外源性Tenascin-c后對collagenⅡ，aggrecan，MMP活性表達(dá)的影響，從而研究Tenascin-c對椎間盤退行性病是否起到保護(hù)作用。
　　體內(nèi)實(shí)驗(yàn):sham組:8-12周齡的balb-c雌性小鼠18只，開腹后暴露L2～L8脊柱，之后關(guān)腹，縫合。
　　手術(shù)組:8-12周齡的balb-c

5、雌性小鼠18只，開腹后暴露L2～L8脊柱，使用27號針頭針刺腰椎間盤L3-L4，關(guān)腹縫合。
　　術(shù)后于1，3，7天收取各組6只小鼠脊柱樣本，石蠟包埋，做組織切片，做Tenascin-c的免疫組化染色。觀察Tenascin-c的表達(dá)情況及表達(dá)位置，研究Tenascin-c在體內(nèi)表達(dá)的情況。
　　結(jié)果：
　　與對照組相比，IL-1β刺激椎間盤細(xì)胞24小時(shí)之后，Tenascin-c蛋白水平表達(dá)顯著增高(P＜0.05)。

6、>　　與對照組相比，IL-1β刺激不同時(shí)間時(shí)，Tenascin-c在基因水平上12小時(shí)達(dá)到峰值(P＜0.05)，24小時(shí)開始降低，collagenⅡ，aggrecan在24小時(shí)開始降低(P＜0.05)。
　　與對照組相比，IL-1β刺激后，MMP mRNA水平的表達(dá)明顯增高(P＜0.05)，且MMP的活性也明顯增高(P＜0.05)。
　　加入外源性Tenascin-c后，給予相同的IL-1β刺激，MMP的活性降低，基因水平上

7、collagenⅡ的表達(dá)升高(P＜0.05)，aggrecan無明顯降低，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　術(shù)后1，3，7天的小鼠取脊柱樣本石蠟包埋，做組織切片，同時(shí)做sham組與手術(shù)組的Tenascin-c的免疫組化染色，手術(shù)組Tenascin-c的表達(dá)明顯高于sham組，且于第7天表達(dá)最多。
　　結(jié)論：
　　1、在椎間盤退行性病變時(shí)，Tenascin-c表達(dá)增高，
　　2、Tenascin-c的表達(dá)隨時(shí)間而