與ALS-FTD相關(guān)的GGGGCC六核苷酸重復(fù)擴(kuò)增非編碼RNA介導(dǎo)神經(jīng)退行性病變.pdf

1、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥(Amyotrophiclateralsclerosis,ALS)和額顳葉癡呆(Frontotemporaldementia,FTD)是兩種漸進(jìn)性且致命的神經(jīng)退行性疾病,臨床上沒(méi)有有效的治療方法。ALS特征性的病理表現(xiàn)為上、下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元退變,臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性肌肉萎縮、痙攣,構(gòu)音不清,吞咽和呼吸困難。FTD是老年性癡呆的第二大病因,特征性的病理表現(xiàn)為大腦額顳葉萎縮,臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性人格、行為改變,認(rèn)知障礙和記憶減退。

2、ALS和FTD在臨床表現(xiàn),病理特征和遺傳特征等方面具有重疊性。ALS越來(lái)越廣泛地被認(rèn)為是一種多系統(tǒng)損傷疾病,超過(guò)50％的患者有額顳葉功能損傷表現(xiàn),如認(rèn)知障礙和行為改變。與此類似的是,大約一半的FTD患者病情會(huì)發(fā)展有運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元損傷的癥狀。最近發(fā)現(xiàn)在許多ALS患者和FTD患者基因組中轉(zhuǎn)錄激活反應(yīng)DNA結(jié)合蛋白-43(transactiveresponseDNAbindingprotein-43,TDP-43)發(fā)生突變,并發(fā)現(xiàn)在這些患者的中樞

3、神經(jīng)系統(tǒng)中有TDP-43陽(yáng)性包涵體形成。
　　針對(duì)許多家族性ALS或FTD或ALS-FTD(指一個(gè)家族中含ALS和FTD兩種患者)的遺傳學(xué)研究中,發(fā)現(xiàn)在部分家族性患者的9號(hào)染色體短臂2區(qū)1帶(chromosome9p21)存在致病基因。后來(lái),針對(duì)散發(fā)型ALS或FTD的全基因組相關(guān)性分析(Genome-wideassociationstudies,GWAS)也發(fā)現(xiàn)在相同的區(qū)域存在遺傳缺陷。最近,兩個(gè)獨(dú)立的研究小組發(fā)現(xiàn),在ALS和FT

4、D患者9號(hào)染色體開(kāi)放閱讀框72基因(chromosome9openreadingframe72,C9ORF72)的非編碼區(qū)存在大量的GGGGCC六核苷酸重復(fù)擴(kuò)增序列。該突變導(dǎo)致C9ORF72轉(zhuǎn)錄子表達(dá)減少,以及含有GGGGCC六核苷酸重復(fù)擴(kuò)增序列的核內(nèi)RNAfoci形成,并發(fā)現(xiàn)在家族性或散發(fā)性ALS和FTD,特別是ALS-FTD患者中,C9ORF72基因GGGGCC六核苷酸重復(fù)擴(kuò)增突變是最常見(jiàn)的遺傳病因。
　　人類已經(jīng)發(fā)現(xiàn)很多單基

5、因寡核苷酸重復(fù)擴(kuò)增非編碼RNA(Non-codingRNA)所導(dǎo)致的神經(jīng)遺傳性疾病,如FMR1基因5’非翻譯區(qū)(5’UTR)的CGG三核苷酸重復(fù)擴(kuò)增引起的脆性X震顫/共濟(jì)失調(diào)綜合征(FragileXTremor/AtaxiaSyndrome,FXTAS),DMPK基因3’非翻譯區(qū)(3’UTR)的CTG三核苷酸重復(fù)擴(kuò)增引起的強(qiáng)直性肌營(yíng)養(yǎng)不良1型(myotonicdystrophytype1,DM1)。多數(shù)情況下,這些異常擴(kuò)增的非編碼RNA

6、對(duì)基因具有調(diào)控作用,如抑制基因轉(zhuǎn)錄、蛋白功能喪失(loss-of-function),從而導(dǎo)致細(xì)胞毒性。此外,寡核苷酸重復(fù)擴(kuò)增非編碼RNA與RNA結(jié)合蛋白(RNA-bindingproteins,RBPs)相互結(jié)合,在核內(nèi)形成核酸聚集物,從而導(dǎo)致神經(jīng)退行性病變。
　　但是GGGGCC六核苷酸重復(fù)擴(kuò)增非編碼RNA(r(GGGGCC)n)與ALS/FTD發(fā)病的關(guān)系以及病理機(jī)制仍然不明。r(GGGGCC)n是否能夠直接導(dǎo)致神經(jīng)退行性變,

7、以及通過(guò)何種機(jī)制導(dǎo)致神經(jīng)退行性變,目前沒(méi)有報(bào)道。
　　本研究利用小鼠成神經(jīng)瘤細(xì)胞模型以及轉(zhuǎn)基因果蠅模型證明含有30個(gè)GGGGCC六核苷酸重復(fù)擴(kuò)增的非編碼RNA(r(GGGGCC)30)導(dǎo)致神經(jīng)退行性變。r(GGGGCC)n通過(guò)富集嘌呤豐富單鏈DNA結(jié)合蛋白alpha(purine-richsingle-strandedDNA-bindingproteinalpha,Puralpha),干擾它的正常功能,從而導(dǎo)致神經(jīng)退行性病變。

8、r>　　1.GGGGCC六核苷酸重復(fù)擴(kuò)增序列抑制下游基因轉(zhuǎn)錄
　　為了研究GGGGCC六核苷酸重復(fù)擴(kuò)增序列對(duì)基因表達(dá)的影響,我們分別構(gòu)建了野生型((GGGGCC)3)和突變型((GGGGCC)30)六核苷酸重復(fù)序列真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒。該六核苷酸重復(fù)序列位于載體pEGFP-N3的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和翻譯起始位點(diǎn)之間。將以上質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到Neuro-2a細(xì)胞48h后,我們發(fā)現(xiàn),與陰性對(duì)照組(EGFP)和野生組((GGGGCC)3-EGFP)相

9、比,突變組((GGGGCC)30-EGFP)EGFPmRNA水平和蛋白水平均明顯降低。提示GGGGCC六核苷酸重復(fù)擴(kuò)增序列抑制下游基因EGFP的轉(zhuǎn)錄。
　　2.GGGGCC六核苷酸重復(fù)擴(kuò)增非編碼RNA介導(dǎo)神經(jīng)退行性病變
　　為了研究GGGGCC六核苷酸重復(fù)擴(kuò)增非編碼RNA是否導(dǎo)致神經(jīng)退行性變,我們構(gòu)建了能夠表達(dá)野生型和突變型r(GGGGCC)n的Neuro-2a細(xì)胞模型。用Cell-TiterBlueAssay法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后4

10、8h各組細(xì)胞活力發(fā)現(xiàn),與陰性對(duì)照組和野生組相比,突變組細(xì)胞活力明顯下降。免疫熒光染色發(fā)現(xiàn),突變組細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)形成大量泛素陽(yáng)性包涵體(inclusion),而陰性對(duì)照組和野生組不見(jiàn)或少見(jiàn)泛素陽(yáng)性包涵體。以上表明,r(GGGGCC)n導(dǎo)致Neuro-2a細(xì)胞退行性變。
　　為了進(jìn)一步在體內(nèi)證實(shí)r(GGGGCC)n介導(dǎo)神經(jīng)退變,我們構(gòu)建了能夠表達(dá)野生型和突變型r(GGGGCC)n的轉(zhuǎn)基因果蠅模型。與哺乳動(dòng)物表達(dá)載體pEGFP-N3類似,我

11、們將GGGGCC六核苷酸重復(fù)序列克隆到果蠅轉(zhuǎn)化載體pUAST-EGFP的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和翻譯起始位點(diǎn)之間。用GAL4/UAS(upstreamactivatorsequence)系統(tǒng)控制目的基因(GGGGCC)n-EGFP在果蠅特異性的神經(jīng)組織表達(dá)。
　　Gmr-GAL4可以調(diào)控目的基因在果蠅復(fù)眼神經(jīng)細(xì)胞表達(dá)。我們發(fā)現(xiàn)突變組(Gmr-GAL4/UAS-(GGGGCC)30-EGFP)轉(zhuǎn)基因果蠅復(fù)眼明顯破壞,形成黑色壞死斑,色素沉著減

12、少。此外,我們觀察了5個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)(Day1,Day7,Day14,Day21和Day28)各組轉(zhuǎn)基因果蠅在發(fā)病過(guò)程中的表型變化:隨著年齡增長(zhǎng),突變組轉(zhuǎn)基因果蠅復(fù)眼呈進(jìn)行性破壞,而陰性對(duì)照組(Gmr-GAL4/w1118)轉(zhuǎn)基因果蠅和野生組(Gmr-GAL4/UAS-(GGGGCC)3-EGFP)轉(zhuǎn)基因果蠅復(fù)眼形態(tài)正常。
　　OK371-GAL4可以調(diào)控目的基因在果蠅的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元表達(dá)。我們利用果蠅活動(dòng)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)(Drosophila

13、ActivityMonitorSystem)觀察各組轉(zhuǎn)基因果蠅的運(yùn)動(dòng)活力隨時(shí)間的變化:在羽化成蟲(chóng)后第7天(Day7),各組轉(zhuǎn)基因果蠅運(yùn)動(dòng)活力沒(méi)有明顯差別,但在羽化成蟲(chóng)后第28天(Day28),與陰性對(duì)照組(OK371-GAL4/w1118)和野生組(OK371-GAL4/UAS-(GGGGCC)3-EGFP)轉(zhuǎn)基因果蠅相比,突變組(OK371-GAL4/UAS-(GGGGCC)30-EGFP)轉(zhuǎn)基因果蠅運(yùn)動(dòng)活力明顯降低。
　　這些

14、結(jié)果表明,r(GGGGCC)n可以介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因果蠅進(jìn)行性神經(jīng)退變。
　　3.GGGGCC六核苷酸重復(fù)擴(kuò)增非編碼RNA與Puralpha相互作用
　　很多寡核苷酸重復(fù)擴(kuò)增非編碼RNA通過(guò)富集RBPs介導(dǎo)神經(jīng)退行性疾病。我們推測(cè)r(GGGGCC)n也有類似的作用。分離和鑒定r(GGGGCC)n特異性的RBPs是了解其介導(dǎo)神經(jīng)退行性病變分子機(jī)制的關(guān)鍵途徑。利用人工合成的帶有生物素標(biāo)記的r(GGGGCC)n重復(fù)序列RNA探針與小鼠脊髓

15、勻漿蛋白共孵育,用鏈霉親和素包被的磁珠分離和純化RNA結(jié)合蛋白。經(jīng)過(guò)質(zhì)譜鑒定和蛋白質(zhì)組學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)了100余種RNA結(jié)合蛋白,其中轉(zhuǎn)錄激活蛋白Puralpha含量最多。
　　為了驗(yàn)證r(GGGGCC)n與RBPs結(jié)合的特異性,用未標(biāo)記的r(GGGGCC)n和r(CGG)n重復(fù)序列RNA探針進(jìn)行體外競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示,未標(biāo)記的r(GGGGCC)n和r(CGG)n重復(fù)序列RNA均能夠顯著抑制生物素標(biāo)記的r(GGGGCC)n與RB

16、Ps結(jié)合。
　　為了驗(yàn)證r(GGGGCC)n與Puralpha結(jié)合的特異性,我們構(gòu)建了GST融合蛋白GST-Puralpha(小鼠和果蠅)。用32P標(biāo)記的r(GGGGCC)n重復(fù)序列RNA探針與純化的GST融合蛋白進(jìn)行體外RNA-蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),小鼠和果蠅Puralpha能夠以劑量依賴的方式與RNA探針特異性結(jié)合,而GST和GST-hnRNPA2/B1與RNA探針沒(méi)有特異性結(jié)合。此外,我們用Westernblot技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)r(

17、GGGGCC)n重復(fù)序列與人和小鼠Puralpha結(jié)合,而不與人和小鼠TDP-43結(jié)合。以上結(jié)果表明,Puralpha與r(GGGGCC)n特異性結(jié)合,并且在人,小鼠和果蠅之間具有保守性。
　　為了證實(shí)Puralpha是否與r(GGGGCC)n在體內(nèi)結(jié)合,我們利用Neuro-2a細(xì)胞進(jìn)行了RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀(RNAimmunoprecipitation,RIP)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示,免疫沉淀的(GGGGCC)30-EGFPRNA水平

18、明顯高于EGFP組和(GGGGCC)3-EGFP組,表明Pur-alpha與r(GGGGCC)n在體內(nèi)相互作用。
　　4.Puralpha抑制GGGGCC六核苷酸重復(fù)擴(kuò)增非編碼RNA介導(dǎo)的神經(jīng)退行性變
　　為了研究Puralpha對(duì)r(GGGGCC)n介導(dǎo)的神經(jīng)退行性變的影響,在Neuro-2a細(xì)胞中過(guò)表達(dá)Puralpha,比較共轉(zhuǎn)染48h后陰性對(duì)照組,野生組和突變組細(xì)胞活力。結(jié)果表明,過(guò)表達(dá)Puralpha能夠明顯改善突變

19、組Neuro-2a細(xì)胞活力,干擾Puralpha表達(dá)后Neuro-2a細(xì)胞活力明顯降低。同時(shí),我們將突變型轉(zhuǎn)基因果蠅與Puralpha轉(zhuǎn)基因果蠅雜交,發(fā)現(xiàn)其子代轉(zhuǎn)基因果蠅(Gmr-GAL4/UAS-(GGGGCC)30-EGFP;UAS-Puralpha)復(fù)眼形態(tài)結(jié)構(gòu)明顯改善,色素增加。由此表明Puralpha能夠抑制r(GGGGCC)n介導(dǎo)的果蠅神經(jīng)退變。
　　綜上所述,r(GGGGCC)n通過(guò)富集RNA結(jié)合蛋白Puralpha