巨噬細胞Coronin-1的表達與非Mtb源性自噬相關性的實驗研究.pdf

1、目的：
　　研究巨噬細胞Coronin-1的表達與非Mtb源性細胞自噬的相關性及其可能信號通路。
　　方法：
　　1.構建過表達Coronin-1的質粒pEGFP-C1-Coronin-1，并將其轉染至RAW264.7細胞，通過G418加壓篩選其RAW264.7細胞穩(wěn)定轉染株，即Coronin-1高表達細胞株（RAW264.7-Cor.Plus）。
　　2.構建干擾Coronin-1表達的質粒pGenesil-1

2、-Coronin-1，并將其轉染至RAW264.7細胞，通過G418加壓篩選其RAW264.7細胞穩(wěn)定轉染株，即Coronin-1低表達細胞株（RAW264.7-Cor.Minus）。
　　3.將表達不同水平Coronin-1的三組細胞（空白RAW264.7細胞組、RAW264.7-Cor.Plus組和RAW264.7-Cor.Minus組）分別以完全培養(yǎng)基（空白處理對照）、饑餓、雷帕霉素、環(huán)孢素A等因素處理后，通過RT-PCR法

3、檢測Beclin-1基因的轉錄水平，Western-blot法檢測Beclin-1、Coronin-1、LC3BⅡ/LC3BⅠ的蛋白表達水平。
　　結果：
　　1.經雙酶切及測序鑒定，Coronin-1過表達質粒和siRNA質粒均構建成功；經G418加壓篩選后獲得了表達綠色熒光蛋白的穩(wěn)定轉染株，通過RT-PCR法和Western-blot法檢測該細胞穩(wěn)定篩選株具有過表達或抑制表達Coronin-1的特性。
　　2.空白

4、處理三組細胞，Western-blot法檢測LC3BⅡ/LC3BⅠ的比值：RAW264.7-Cor.Minus組>RAW264.7組>RAW264.7-Cor.Plus組；Western-blot法檢測Beclin-1：RAW264.7-Cor.Minus組>RAW264.7組>RAW264.7-Cor.Plus組；RT-PCR法檢測Beclin-1轉錄水平，趨勢同Western-blot。差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

5、　　3.饑餓處理三組細胞，Western-blot法檢測LC3BⅡ/LC3BⅠ的比值：RAW264.7-Cor.Minus組　　4.雷帕霉素處理RAW264.7細胞，其Coronin-1蛋白被顯著抑制；雷帕霉素和環(huán)孢素A分別處理RAW264.7-Cor.Plus細胞，其LC3BⅡ/LC3BⅠ比值明顯較空白處理照組高。差異均具有統(tǒng)計學

6、意義(P<0.05)。
　　結論：
　　1.本研究探索了高、中、低三種Coronin-1表達水平對巨噬細胞非Mtb源性自噬的影響。結果表明，巨噬細胞Coronin-1與非Mtb源性細胞自噬具有相關性。
　　2.在營養(yǎng)充足狀態(tài)下，巨噬細胞Coronin-1的表達可抑制細胞自噬；雷帕霉素可通過抑制Coronin-1的表達而促進細胞自噬。
　　3.在饑餓狀態(tài)下，巨噬細胞Coronin-1的表達可促進細胞自噬。