肝臟巨噬細(xì)胞天然免疫膜受體的表達(dá)與肝癌的相關(guān)性研究.pdf

1、成人原發(fā)性肝細(xì)胞癌(HCC，包括肝癌和管癌)是全世界癌癥相關(guān)死亡的第二大原因。肝癌構(gòu)成了肝臟中大部分的惡性腫瘤，它一般是由常見(jiàn)的臨床風(fēng)險(xiǎn)因素所致，包括慢性乙肝病毒和丙肝病毒感染，大量酒精攝入，脂肪性肝炎，和糖尿病。大多數(shù)的肝癌都是由慢性乙肝病毒及丙肝病毒感染所致，慢性病毒感染會(huì)發(fā)展成為持續(xù)性的炎癥，導(dǎo)致纖維化/肝硬化伴隨著大量的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。腫瘤內(nèi)不同類型細(xì)胞和其基質(zhì)之間的cross-talk通常會(huì)誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)展。目前，肝癌切除術(shù)仍然是

2、治療肝癌最有效的療法之一。由于較高的復(fù)發(fā)率，肝癌患者的整體術(shù)后存活率仍然不能令人滿意。
　　為了研究巨噬細(xì)胞與肝癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系并尋找可能的免疫預(yù)測(cè)方法，本論文開(kāi)展了如下研究。
　　I.抑制性受體CD200R的表達(dá)與肝癌預(yù)后密切相關(guān)
　　免疫系統(tǒng)有自己的方法來(lái)平衡其免疫反應(yīng)及免疫耐受。一方面，免疫系統(tǒng)識(shí)別并且清除表達(dá)外來(lái)抗原的腫瘤細(xì)胞，而另一方面，它通過(guò)免疫耐受機(jī)制精細(xì)控制對(duì)于表達(dá)自身抗原的細(xì)胞的攻擊。同時(shí)，腫瘤細(xì)胞通

3、過(guò)“免疫編輯”并利用免疫系統(tǒng)的免疫耐受機(jī)制逃避免疫攻擊。免疫逃逸的基本機(jī)制已被廣泛研究，其中之一是通過(guò)操控細(xì)胞活化后表達(dá)的免疫調(diào)控分子。一般認(rèn)為，在癌癥的發(fā)展過(guò)程中，免疫細(xì)胞會(huì)被耗盡并且其功能降低，使得腫瘤細(xì)胞更容易逃逸免疫應(yīng)答。免疫細(xì)胞的耗盡通常伴隨著共抑制分子的高表達(dá)，對(duì)這些負(fù)調(diào)分子的操控可以很好的恢復(fù)免疫應(yīng)答，從而起到對(duì)抗腫瘤細(xì)胞的作用。
　　抑制性CD200: CD200R軸對(duì)于早期微生物感染時(shí)防止炎癥反應(yīng)和免疫病理至關(guān)重

4、要。在幾種腫瘤模型中都已經(jīng)驗(yàn)證了CD200的表達(dá)與癌癥的發(fā)展是密切相關(guān)的，且阻斷這條通路可以恢復(fù)抗腫瘤的免疫應(yīng)答。CD200廣泛表達(dá)于多種細(xì)胞類型，包括實(shí)體瘤和惡性血液瘤，而它的受體CD200R，主要表達(dá)在髓系來(lái)源和淋巴系來(lái)源的免疫細(xì)胞上。CD200-CD200R軸似乎有助于腫瘤細(xì)胞逃逸以及對(duì)免疫應(yīng)答的抑制。由于CD200-CD200R軸在不同的腫瘤模型中都抑制了免疫應(yīng)答，并且不同程度直接或者間接的干擾了免疫細(xì)胞的活動(dòng)，我們因此探究了C

5、D200-CD200R軸與肝癌之間的相關(guān)性。
　　雖然癌癥患者的免疫抑制狀態(tài)眾所周知，大量的證據(jù)表明，在腫瘤局部發(fā)生的炎癥反應(yīng)同樣可以促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和發(fā)展。肝癌通常由伴隨著廣泛白細(xì)胞浸潤(rùn)的肝硬化誘導(dǎo)而來(lái)。在這些浸潤(rùn)的白細(xì)胞當(dāng)中，巨噬細(xì)胞來(lái)源的枯否細(xì)胞通常集中在癌周基質(zhì)，而在腫瘤中心只有很少的巨噬細(xì)胞存在。通過(guò)在連續(xù)切片上對(duì)CD8，CD57和CD68進(jìn)行免疫組化染色，我們?cè)俅巫C實(shí)了肝癌組織中大量CD68+細(xì)胞的存在。此外，大多數(shù)CD

6、200R細(xì)胞與CD68+細(xì)胞共定位，證實(shí)了在這種特殊狀態(tài)下CD68+巨噬細(xì)胞上CD200R的表達(dá)。
　　值得注意的是，肝癌與其他惡性腫瘤不同，肝癌的預(yù)后不僅僅取決于腫瘤的分期，還取決于伴隨著的肝硬化引起的功能障礙。因此，我們進(jìn)一步研究了CD200R在肝損傷中的作用。CD200R高表達(dá)患者和CD200R低表達(dá)患者之間AST水平的比較表明CD200R高表達(dá)的患者的血液中的AST表達(dá)也更高。肝癌患者通常伴有較高的腫瘤復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率，可以

7、預(yù)測(cè)肝癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的潛在生物標(biāo)志物的探索顯得尤為重要。在我們的研究中，我們發(fā)現(xiàn)CD200R高表達(dá)患者的總體生存率和無(wú)復(fù)發(fā)生存率都要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于CD200R低表達(dá)患者，預(yù)示了CD200R作為一個(gè)可預(yù)測(cè)肝癌預(yù)后復(fù)發(fā)及生存的指標(biāo)的可能性。
　　我們的研究結(jié)果提示過(guò)強(qiáng)的CD200R信號(hào)通路可導(dǎo)致免疫耐受以抑制肝癌患者中的免疫功能。同時(shí)，也預(yù)示阻斷這條信號(hào)通路可以逆轉(zhuǎn)腫瘤的免疫逃逸以恢復(fù)抗腫瘤免疫應(yīng)答，提示了CD200R在提高免疫治療功效中潛在

8、的作用。另一方面，CD200R信號(hào)通路不僅可以抑制免疫應(yīng)答，它同時(shí)也會(huì)抑制促進(jìn)腫瘤的炎癥反應(yīng)。對(duì)CD200-CD200R相互作用的阻斷增強(qiáng)了抗腫瘤反應(yīng)的同時(shí)也增強(qiáng)了促進(jìn)腫瘤的炎癥反應(yīng)，這樣的炎癥反應(yīng)最終也將導(dǎo)致肝癌的發(fā)展。因此，當(dāng)用CD200R作為checkpoint來(lái)進(jìn)行阻斷的同時(shí)其促進(jìn)炎癥的這一方面也不容忽視。我們需要找到其中的平衡才能更好的使用它為臨床作出貢獻(xiàn)。
　　總而言之，我們首次證明了癌周基質(zhì)中CD200R的表達(dá)可以作

9、為潛在的指標(biāo)預(yù)測(cè)肝癌的發(fā)展和預(yù)后。CD200R高表達(dá)患者有可能伴隨更為嚴(yán)重的惡性腫瘤，更高的復(fù)發(fā)率和更低的生存率。因?yàn)槟壳搬槍?duì)肝癌治療的方法是非常有限的，CD200R可以被認(rèn)為是一個(gè)治療肝癌的潛在治療靶點(diǎn)。然而，詳細(xì)的機(jī)制需要進(jìn)一步的研究，更多更全面的研究才能使我們到達(dá)這一目的。
　?、?MARCO低表達(dá)與肝癌病程發(fā)展及患者生存預(yù)后密切相關(guān)
　　天然免疫細(xì)胞可以通過(guò)包括清道夫受體(SR)等一系列的模式識(shí)別受體，來(lái)對(duì)外界抗原及

10、病原體進(jìn)行免疫識(shí)別。巨噬細(xì)胞膠原結(jié)構(gòu)受體(MARCO)來(lái)自于A類清道夫受體家族，其具體的特征是胞外段存在膠原和富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域。兩種受體均在巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞上表達(dá)，其功能是在多種細(xì)胞上作為分子傳感器，同時(shí)作為吞噬受體與各種微生物組分進(jìn)行結(jié)合。然而，一些研究線索表明，清道夫受體除了模式識(shí)別和吞噬清除的功能外，還存在其他的潛在功能。MARCO表達(dá)于非常特定的巨噬細(xì)胞亞群，其表達(dá)會(huì)在機(jī)體發(fā)生細(xì)菌感染后在炎癥部位大量提升。這些特性提示我

11、們，MARCO除了模式識(shí)別和吞噬清除的功能外，還發(fā)揮調(diào)節(jié)免疫炎癥和免疫應(yīng)答的潛在功能。
　　人類和小鼠的肝臟中均含有豐富的天然免疫淋巴細(xì)胞，如NK細(xì)胞，NKT細(xì)胞和枯否細(xì)胞。鑒于現(xiàn)有的證據(jù)表明，MARCO在巨噬細(xì)胞上高表達(dá)，我們進(jìn)一步檢測(cè)了MARCO在肝臟中的可能發(fā)揮的潛在角色。有趣的是，公開(kāi)基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)(Oncomine，www.oncomine.org)中表明，在正常肝組織MARCO的mRNA表達(dá)比在HCC顯著升高。在我們的

12、研究中發(fā)現(xiàn)，通過(guò)免疫組化染色檢測(cè)MARCO在肝癌組織中的表達(dá)水平，將IOD/area做為MARCO蛋白表達(dá)的量度。較高的IOD/area意味著更高的表達(dá)，反之則意味著MARCO表達(dá)降低。與基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)的結(jié)果一致，在我們的肝癌組織和癌旁組織樣品中，無(wú)論是蛋白質(zhì)水平和mRNA的表達(dá)水平，MARCO在腫瘤內(nèi)組織顯著低于癌旁正常組織，提示MARCO在肝癌組織微環(huán)境中，發(fā)揮著重要作用。
　　此外，我們的研究結(jié)果顯示，MARCO在健康志愿者

13、的肝臟中的表達(dá)水平最高，其次是肝硬化患者，肝癌患者，肝癌轉(zhuǎn)移患者，而這又與基因數(shù)據(jù)庫(kù)的結(jié)論相統(tǒng)一。我們還進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，在腫瘤周圍間質(zhì)區(qū)域和癌組織之間，MARCO表達(dá)會(huì)形成很明顯的一條清晰邊界，在癌內(nèi)MARCO表達(dá)明顯的低于癌旁的組織。健康對(duì)照組的MARCO表達(dá)顯著性高于肝癌患者和肝癌轉(zhuǎn)移患者，MARCO的表達(dá)隨著肝癌病情的加重，會(huì)在肝臟組織中逐漸降低。
　　通過(guò)進(jìn)一步的分析，我們發(fā)現(xiàn)MARCO表達(dá)水平不僅會(huì)伴隨著疾病的進(jìn)程而越來(lái)越低

14、，MARCO的表達(dá)與腫瘤的分期進(jìn)展密切相關(guān)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，處在TNM早期患者的肝臟組織中MARCO表達(dá)水平顯著高于處在TNM晚期的患者，而且在有明顯腫瘤包膜的患者體內(nèi)MARCO表達(dá)也會(huì)顯著高于沒(méi)有腫瘤包膜的患者，這兩個(gè)參數(shù)通常都與腫瘤的嚴(yán)重性密切相關(guān)。這些數(shù)據(jù)表明，MARCO表達(dá)水平會(huì)沿著疾病進(jìn)程和腫瘤進(jìn)展，而逐漸減少減低，提示我們?cè)陬A(yù)測(cè)肝癌相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，MARCO存在作為腫瘤預(yù)后標(biāo)志物的潛能。
　　盡管癌旁組織與癌組織比

15、較，往往會(huì)被認(rèn)為是“相對(duì)正常”組織，然而癌旁組織在鏡下觀察，也會(huì)存在不同程度的炎癥反應(yīng)。枯否細(xì)胞是肝臟駐留的巨噬細(xì)胞，其與肝臟內(nèi)的炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。在識(shí)別外來(lái)抗原方面，枯否細(xì)胞可以被活化并釋放多種炎癥介質(zhì)，包括多種細(xì)胞因子(TNF-α，IL-1β和IL-6)，趨化因子（單核細(xì)胞趨化蛋白-1，MCP-1），巨噬細(xì)胞炎性蛋白(MIP)-1α，MIP-1β和RANTES等。我們的結(jié)果中通過(guò)激光共聚焦檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，CD68+巨噬細(xì)胞標(biāo)記和MARCO

16、+標(biāo)記會(huì)共定位在同一細(xì)胞上，證實(shí)在肝癌組織中MARCO的表達(dá)主要是在枯否細(xì)胞上表達(dá)。
　　腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，可以嚴(yán)重影響術(shù)后生活質(zhì)量和術(shù)后存活率。在我們的研究中發(fā)現(xiàn)，MARCO的表達(dá)與患者術(shù)后的生存預(yù)后密切相關(guān)，肝癌組織中高表達(dá)MARCO的患者會(huì)伴隨著更久的生存周期時(shí)間，這些結(jié)果提示MARCO在HCC患者中具有預(yù)測(cè)生存預(yù)后的價(jià)值。
　　終上所述，本研究工作首次闡明了MARCO和肝癌之間的相互關(guān)系。尤其是我們的結(jié)果表明，患者的肝

17、癌組織內(nèi)低表達(dá)MARCO，會(huì)伴隨著更差的疾病預(yù)后和生存周期下降。在本研究工作中，我們提供了充分的證據(jù)表明MARCO在肝癌病人中發(fā)揮著重要角色，這些發(fā)現(xiàn)之前都沒(méi)有被研究和報(bào)道過(guò)。然而，MARCO在肝癌患者中低表達(dá)是否是疾病惡化的原因或只是其預(yù)后不良的結(jié)果仍存在不清楚的地方。一方面，鑒于MARCO主要表達(dá)于巨噬細(xì)胞，但駐留在肝癌腫瘤組織中的巨噬細(xì)胞較少，所以檢測(cè)到的MARCO表達(dá)強(qiáng)度降低可能是由于在肝癌組織中的巨噬細(xì)胞表達(dá)減少導(dǎo)致。另一方面