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文檔簡介
1、目的:
研究巨噬細(xì)胞冠蛋白1(Coronin-1)與分枝菌酸(MA)誘導(dǎo)細(xì)胞泡沫化的相關(guān)性及其可能機(jī)制。
方法:
1.據(jù)Coronin-1表達(dá)水平的差異,實(shí)驗(yàn)分為RAW264.7-Cor.Plus(過表達(dá))、RAW264.7(正常表達(dá))和RAW264.7-Cor.Minus(抑制表達(dá))三組。三組細(xì)胞分別用(0、25、50、75、100)μg/mL MA包被的聚苯乙烯微球作為吞噬顆粒,分別吞噬24、48、72
2、 h,5、8 d;細(xì)胞通過油紅O染色后,直接觀察細(xì)胞內(nèi)脂滴堆積情況,并用總膽固醇(TC)酶法測定試劑盒、游離膽固醇(FC)酶法測定試劑盒分別檢測各組細(xì)胞TC、FC,再通過膽固醇酯(CE)和CE/TC比值定量評估巨噬細(xì)胞泡沫化水平。
2.各組細(xì)胞經(jīng)100μg/mL MA包被的聚苯乙烯微球作用24h后提取總蛋白,用RT-PCR、Western-blot法檢測細(xì)胞Coronin-1的表達(dá)水平。
3.三組細(xì)胞經(jīng)2μmol/L
3、松胞菌素D(ctyD)處理后,分別用(0、25、50、75、100)μg/mL MA包被的聚苯乙烯微球作為吞噬顆粒,分別吞噬24、48、72 h,5、8 d,再次測定其細(xì)胞泡沫化水平。
4.將ctyD處理細(xì)胞(RAW264.7-ctyD、RAW264.7-ctyD-MA)及其對照組分別用異硫氰酸熒光素標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽(FITC-phalloidin)染色,計(jì)算纖維型肌動(dòng)蛋白(F-actin)重排率。
5.三組細(xì)胞分別經(jīng)
4、(0、25、50、75、100)μg/mL MA包被的聚苯乙烯微球作用24、48、72 h,5、8 d,通過定磷法測定鈣調(diào)磷酸酶活性,并用Western-blot法測定實(shí)驗(yàn)組(100μg/mL MA,作用24h)及其對照組細(xì)胞的鈣調(diào)磷酸酶表達(dá)水平。
結(jié)果:
1.受不同包被濃度的MA誘導(dǎo)后,表達(dá)不同水平Coronin-1的各組細(xì)胞的泡沫化水平與MA包被劑量和MA作用時(shí)間呈正比;Coronin-1表達(dá)量最高的RAW264
5、.7-Cor.Plus細(xì)胞泡沫化水平最高,Coronin-1表達(dá)量最低的RAW264.7-Cor.Minus細(xì)胞泡沫化水平最低,其泡沫化水平呈現(xiàn)的趨勢為:RAW264.7-Cor.Plus>RAW264.7>RAW264.7-Cor.Minus。
2.各組細(xì)胞受MA誘導(dǎo)后,其Coronin-1的表達(dá)量顯著高于相應(yīng)對照組,其表達(dá)量從高至低依次為RAW264.7-Cor.Plus、RAW264.7、RAW264.7-Cor.Min
6、us。
3.ctyD處理組細(xì)胞與相應(yīng)的未處理組相比,ctyD處理組細(xì)胞泡沫化水平顯著低于其未處理對照組。但是, ctyD處理組細(xì)胞泡沫化水平呈現(xiàn)的趨勢仍然為:RAW264.7-Cor.Plus>RAW264.7>RAW264.7-Cor. Minus。ctyD抑制巨噬細(xì)胞F-actin顯著降低了MA誘導(dǎo)的泡沫化水平,但抑制F-actin對Coronin-1與MA誘導(dǎo)細(xì)胞泡沫化的正相關(guān)性并無顯著影響。
4.經(jīng)熒光素標(biāo)記
7、的鬼筆環(huán)肽染色后,MA誘導(dǎo)組細(xì)胞的F-actin重排率顯著高于非MA誘導(dǎo)的對照組細(xì)胞。
5.三組細(xì)胞經(jīng)不同包被濃度MA微球誘導(dǎo)不同時(shí)間后,在相同MA包被濃度和相同作用時(shí)間下,其鈣調(diào)磷酸酶活性從高至低依次為:RAW264.7-Cor.Plus>RAW264.7>RAW264.7-Cor.Minus,但是,如果MA作用時(shí)間為5~8d,三組細(xì)胞鈣調(diào)磷酸酶活性穩(wěn)定在一個(gè)較低水平,差異無顯著性;三組細(xì)胞經(jīng)100μg/mL包被濃度的MA微
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