乳鐵蛋白免疫復(fù)合物活化人單核細(xì)胞的分子機(jī)制研究.pdf

1、乳鐵蛋白（LTF）是一種分子量為80KD的可溶性鐵離子結(jié)合糖蛋白，屬于轉(zhuǎn)鐵蛋白家族一員，具有多種生物學(xué)功能，如抑制細(xì)菌生長(zhǎng)、抗真菌、抗腫瘤、抗病毒及免疫調(diào)節(jié)。LTF特異性抗體是抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體（ANCA）的一種，常見(jiàn)于自身免疫性疾病患者血清中。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)RA患者血清中乳鐵蛋白免疫復(fù)合物（LTF-IC）的含量顯著升高，且從RA病人血漿置換液中純化的抗LTF抗體與LTF結(jié)合形成的免疫復(fù)合物在體外能夠活化人單核細(xì)胞釋放TNF-?

2、。應(yīng)用兔抗LTF多克隆抗體L3262與LTF形成的免疫復(fù)合物也能夠強(qiáng)烈刺激人單核細(xì)胞釋放TNF-?、IL-1β、IL-8等。
　　為了對(duì)LTF-IC的免疫生物學(xué)活性做更為深入細(xì)致的研究，我們通過(guò)雜交瘤細(xì)胞融合技術(shù)制備了一株小鼠抗LTF的單克隆抗體，并證實(shí)該抗體與LTF形成的復(fù)合物同樣能夠誘導(dǎo)單核細(xì)胞釋放促炎性細(xì)胞因子。本課題就LTF-IC活化單核巨噬細(xì)胞的分子機(jī)制、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，尤其是 LTF-IC與病原體模式分子（LPS）之間的

3、協(xié)同作用機(jī)制進(jìn)行探討，力爭(zhēng)發(fā)現(xiàn)RA發(fā)病的新機(jī)制，為尋找可用于臨床早期診斷的生物標(biāo)志物和免疫治療的新靶點(diǎn)奠定基礎(chǔ)。
　　本研究的主要發(fā)現(xiàn)包括：（1）免疫復(fù)合物與LTF及LPS的協(xié)同作用誘導(dǎo)人單核細(xì)胞促炎性細(xì)胞因子的釋放，該過(guò)程依賴CD14，TLR4和FcγRⅡa的激活。（2)LTF-IC激活單核巨噬細(xì)胞過(guò)程有賴于脂筏結(jié)構(gòu)的完整和參與。通過(guò)共聚焦及提取脂筏發(fā)現(xiàn) LTF-IC可誘導(dǎo)相應(yīng)受體募集至脂筏結(jié)構(gòu)，且脂筏破壞劑 M-β-環(huán)糊精（M

4、βCD）能夠抑制LTF-IC活化單核細(xì)胞釋放TNF-?。（3）固相化IgG協(xié)同LTF和 LPS作用的 mir-221-3p-SOCS1/SOCS3-p65通路。通過(guò)抑制劑干預(yù)以及western-blot方法發(fā)現(xiàn)LTF-IC活化單核細(xì)胞依賴FcγRⅡa下游的Src激酶和Syk激酶的活化，進(jìn)而誘導(dǎo) PI3K發(fā)生磷酸化，與 TLR4介導(dǎo)的信號(hào)通路共同激活下游MAPK以及NF-κB，但不依賴于對(duì)Akt的激活。
　　對(duì)比TLR4介導(dǎo)NF-κ

5、B信號(hào)通路的時(shí)間曲線，LTF-IC對(duì)NF-κB的激活在程度以及持續(xù)時(shí)間上均顯著增強(qiáng)，提示FcγRIIa介導(dǎo)的協(xié)同信號(hào)很可能影響了TLR4信號(hào)通路激活后相應(yīng)的負(fù)調(diào)控基因的表達(dá)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，LTF-IC處理細(xì)胞后TLR4下游的負(fù)調(diào)控基因 SOCS1、SOCS3顯著下調(diào)，這可能解除了這些負(fù)調(diào)控基因?qū)?NF-κB的負(fù)反饋調(diào)節(jié)，導(dǎo)致 p65的活化及延長(zhǎng)磷酸化。高通量測(cè)序結(jié)果及Q-PCR驗(yàn)證表明LPS或LTF協(xié)同c-IgG活化單核細(xì)胞能夠顯著上