血清傳鐵蛋白和乳傳鐵蛋白裂解焦磷酸鍵的酶學功能研究.pdf

1、蛋白質的可逆磷酸化作用作為一種調節(jié)機制在生物體中發(fā)揮重要作用。在信號傳導、基因轉錄、DNA復制、細胞分裂與分化等多種生理過程中，許多重要蛋白質和酶的生物活性都被磷酸基團的可逆加合即磷酸化和去磷酸化所調節(jié)。 傳鐵蛋白是一大類遺傳相關、生物功能相似、結構類似的非血紅素鐵結合蛋白。主要包括血清鐵傳運蛋白(serum transferrin，TF)、乳鐵傳運蛋白(lactotransferrin，LF)、卵傳鐵蛋白(ovotransfe

2、rrin，OTF)。分子量約為70～80kDa，由單一肽鏈組成并構成兩個功能相似的結構域，每個結構域分別以2個Tyr、1個Asp和1個His結合1個Fe3+，另有1個CO2-3作為協同陰離子。它們的主要生理功能是負責運輸鐵和協助調節(jié)機體中鐵的平衡。據文獻報導，傳鐵蛋白家族中的某些乳傳鐵蛋白和鐵結合蛋白(細菌中的傳鐵蛋白)具有磷酸(酯)酶的功能，因此，研究傳鐵蛋白磷酸(酯)酶學功能位點和作用機制并進一步確定它們在磷酸化過程的作用具有重要意

3、義。 本課題利用31P NMR及UV-Vis、ESI-MS、ICP-AES等技術，測定了人血清脫金屬傳鐵蛋白(apo-hTF)及牛奶乳傳鐵蛋白與焦磷酸(PPi)及ATP反應的動力學參數，研究了該酶促反應的反應機制。 在10mmol·L-1 pH7.4 Hepes緩沖液中，312K溫度下，PPi與apo-hTF反應時，5～10h后其31P NMR圖譜上在約3.74ppm處出現對應于磷酸根的新信號峰，隨著反應的進行，對應于P

4、Pi(-6.59ppm)峰的強度逐漸降低而對應于Pi的峰強度逐漸增大，說明apo-hTF具有催化裂解焦磷酸鍵的酶學功能。根據不同時間PPi的濃度和微分法原理，通過作圖法發(fā)現該酶促反應為二級反應，當[PPi]：[apo-hTF]=16：1、27：1、38：1、50：1時，表觀反應速率常數分別為3.67x10-4、1.91×10-4、1.22x10-4、8.53x10-4L·mmol-1·h-1(pH7.40，312K)。用初速率法測定速率

5、常數為0.010382mmol·L-1·h-1(零級反應)。該酶促反應米氏常數Km為3.600，vm為0.00864mmol·L-1·h-1。 在10mmol．L-1 pH7.4 Hepes緩沖液中，298K時，向apo-hTF溶液中滴加PPi，在UV-Vis差譜上于245nm處產生一個負吸收峰，峰強度隨著：PPi濃度的增加而下降。這與PPi和Tyr直接反應的結果相似，說明PPi可通過氫鍵結合于apo-hTF中Fe3+的結合位點

6、酪氨酸上(而His與PPi的結合卻很弱)。當[PPi]：[apo-hTF]為2：1時結合達飽和，ICP-AES分析結果顯示每蛋白分子可結合3.5個P，證實了該結果。因此，可以推測apo-hTF催化裂解焦磷酸鍵的反應分為兩個步驟：PPi先通過氫鍵結合于蛋白中Fe3+的結合位點上，再發(fā)生催化水解反應。 實驗發(fā)現Ca2+對該酶促反應具有微弱的催化作用，表觀反應速率常數為2.31×10-4L·mmol-1·h-1(pH7.40，312K

7、)。 相同條件下，holo-hTF對PPi幾乎沒有作用，可能是因為holo-hTF中Fe3+的結合位點酪氨酸被封閉，PPi不能結合于該活性中心的緣故。Apo-hTF對ATP也沒有作用，也可能是由于ATP分子較大，不能進入到apo-hTF中的活性中心的緣故。 與holo-hTF不同，乳鐵蛋白(LF)具有催化裂解焦磷酸鍵的酶學功能，反應也遵循二級動力學特征，當[PPi]：[LF]=20：1、40：1、60：1、80：1、10

8、0：1時，測得表觀反應速率常數分別為：3.45x10-4、2.42×10-4、1.36x10-4、3.30x10-5、2.50x10-6L·mmol-1·h-1(pH7.40，312K)。用初速率法測定反應速率常數為0.00253mmol·L-1·h-1(零級反應)。該酶促反應的米氏常數Km為3.539，vm為0.026247mmol·L-1·h-1。 實驗發(fā)現apo-hTF、LF都有催化裂解PPi的磷酸(酯)酶功能，PPi首先