豬睪丸細胞多次傳代的CSFV E2基因遺傳變異及E2蛋白在細胞中表達的研究.pdf

1、豬瘟病毒(CSFV)E2基因是目前研制豬瘟基因工程疫苗的首選基因，其所編碼的gp55蛋白是CSFV的主要保護性抗原。采用豬睪丸細胞(ST)做為受體細胞，結合使用哺乳動物細胞表達載體來表達E2基因，首先可充分利用受體細胞遺傳密碼子的嗜好性提高重組蛋白的表達量，另外因ST來源于豬，其后加工與其他表達宿主相比具有優(yōu)越性，其疫苗的免疫保護力和免疫原性有望得到進一步提高，為CSFV基因工程疫苗推廣應用奠定基礎。
　　 本研究包括三個試驗內

2、容，首先對CSFV福建地方流行株FJ1和FJ2株的E2基因進行了克隆與測序，分析與豬瘟(CSF)疫苗C株的同源性，初步了解福建地方分離株的變異情況。其次利用反轉錄PCR(RT-PCR)和套式PCR(nPCR)方法，對多次ST傳代的和多次動物傳代的CSF石門強毒株(Shimen株)E2基因的序列分別進行了測定，并與標準Shimen株E2基因的核苷酸和氨基酸序列的同源性進行比較，旨在探討CSFV在ST中多次傳代后的遺傳穩(wěn)定性。最后利用ST作

3、為受體細胞來表達CSFV的E2基因，為建立用重組蛋白作為抗原的CSFV檢測方法和CSF基因工程疫苗的應用奠定基礎。本研究試驗與結果如下：
　　 1.使用：PCR技術分別擴增2株CSF福建地方流行毒株的E2基因，并克隆于pMD-18T載體進行核苷酸測序，根據(jù)CSFV的Alfort株、Brescia株及C-株(疫苗毒)確定起始氨基酸三聯(lián)體位置后進行氨基酸序列推導，同時進行同源性比較和E2蛋白結構分析。結果顯示，F(xiàn)J1和FJ2株的E2

4、基因的長度均為1170 bp，編碼的氨基酸序列長度均為384個氨基酸，包括完整的信號肽和部分跨膜序列。2毒株的E2基因核苷酸序列同源性為90.79％，氨基酸序列同源性為89.84％，其與C-株E2基因的核苷酸序列同源性為82.87％-82.96％，氨基酸序列同源性為87.76％-90.10％，結果表明，2008年福建部分地區(qū)CSF流行毒與C-株的E2蛋白之間存有一定差異，這為當前CSF防控奠定一定理論與物質基礎。
　　 2.CS

5、FV Shimen株經(jīng)豬體多次傳代和ST多次傳代后，得到傳代病毒P-Shimen和ST-Shimen。利用PCR技術分別擴增P-Shimen和ST-Shimen株E2基因，并進行核苷酸序列測定，比較分析P-Shimen株、ST-Shimen株及Shimen標準株的E2基因核苷酸和氨基酸序列同源性。結果發(fā)現(xiàn)，P-Shimen株和Shimen標準株核苷酸序列同源性為99.4％，氨基酸序列同源性為99.0％，ST-Shimen株和Shimen

6、標準株的核苷酸序列同源性為98.3％，氨基酸同源性為96.7％，結果顯示，ST-Shimen株E2基因較P-Shimen株的變異差異不明顯，并與Shimen標準株保持較高的同源性，結果表明了CSFV在ST中能保持其遺傳的相對穩(wěn)定性，為ST作為CSF疫苗制備的工具細胞提供可能。
　　 3.克隆CSFV的E2基因至pEGFP-C1真核表達載體上，使用脂質體法將重組質粒轉染入ST中，通過熒光觀察和G418篩選出陽性細胞克隆。熒光觀察和