豬瘟病毒貴州流行株E2基因表達載體的構(gòu)建及原核表達的研究.pdf

1、豬瘟(Classicalswinefever，CSF)是由豬瘟病毒(CSFV)引起的豬的高度接觸性傳染病，嚴重危害養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。在20世紀60年代，我國豬瘟兔化弱毒疫苗問世并推廣應(yīng)用，有效地控制了豬瘟的大流行。近來年，豬瘟的流行和發(fā)病特點發(fā)生了重要變化，出現(xiàn)了非典型豬瘟、溫和型豬瘟，給豬瘟的防制、臨床診斷和免疫監(jiān)測帶來一些新的難題。部分原因是豬瘟兔化弱毒疫苗長期高強度的免疫，已使CSFV野毒株及兔化弱毒抗原發(fā)生了變異，導(dǎo)致有些地區(qū)發(fā)生疫

2、苗免疫失敗現(xiàn)象。近年來許多學者利用生物分子技術(shù)，正在開展豬瘟新型疫苗的研究，并探索其疫苗效果。
　　本研究對某豬場發(fā)生疑似豬瘟的疫情，通過流行病學調(diào)查、臨床診斷、病理剖檢變化、金標卡檢測、免疫熒光抗體試驗、兔體交互試驗、回歸動物實驗的基礎(chǔ)上診斷豬瘟，然后根據(jù)GenBank登錄的豬瘟病毒shimen和C株的E2基因序列設(shè)計一對特異引物，采摘病死豬的血液、扁桃體、淋巴結(jié)、脾、腎等組織提取總RNA，進行RT-PCR擴增，將擴增產(chǎn)物測序后

3、進行核苷酸序列比較分析。結(jié)果表明：該流行毒株是豬瘟病毒，與豬瘟病毒shimen和C毒株核苷酸的同源性分別為98.9％和94.9％。
　　在上述實驗基礎(chǔ)上，選用pMD18-T載體，通過對目的DNA的純化、連接和轉(zhuǎn)化，構(gòu)建了pMD18-T-E2重組質(zhì)粒，抽提重組質(zhì)粒pMD18-T-E2，經(jīng)雙酶切鑒定純化后，將E2基因分別連接到pcDNA3.1(-)和pET-32a(+)表達載體上并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆，經(jīng)酶切和測序，成功構(gòu)建了

4、豬瘟病毒貴州毒株原核表達質(zhì)粒pET32a-E2和真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1-E2。
　　將構(gòu)建好的原核表達質(zhì)粒pET32a-E2，轉(zhuǎn)化至宿主菌BL21中，誘導(dǎo)表達目的蛋白，表達產(chǎn)物做SDS-PAGE電泳、Western-blot分析，得到了約58kDa左右條帶，與預(yù)期大小相符，表明豬瘟E2基因在大腸桿菌中進行了高效表達，并具有一定的生物學活性。進一步提取、純化目的蛋白，將目的蛋白加入弗氏佐劑免疫小鼠，免疫后采血檢測抗體，結(jié)果顯示