豬瘟病毒貴州流行株E2基因表達(dá)載體的構(gòu)建及原核表達(dá)的研究.pdf

1、豬瘟(Classicalswinefever，CSF)是由豬瘟病毒(CSFV)引起的豬的高度接觸性傳染病，嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。在20世紀(jì)60年代，我國(guó)豬瘟兔化弱毒疫苗問(wèn)世并推廣應(yīng)用，有效地控制了豬瘟的大流行。近來(lái)年，豬瘟的流行和發(fā)病特點(diǎn)發(fā)生了重要變化，出現(xiàn)了非典型豬瘟、溫和型豬瘟，給豬瘟的防制、臨床診斷和免疫監(jiān)測(cè)帶來(lái)一些新的難題。部分原因是豬瘟兔化弱毒疫苗長(zhǎng)期高強(qiáng)度的免疫，已使CSFV野毒株及兔化弱毒抗原發(fā)生了變異，導(dǎo)致有些地區(qū)發(fā)生疫

2、苗免疫失敗現(xiàn)象。近年來(lái)許多學(xué)者利用生物分子技術(shù)，正在開(kāi)展豬瘟新型疫苗的研究，并探索其疫苗效果。
　　本研究對(duì)某豬場(chǎng)發(fā)生疑似豬瘟的疫情，通過(guò)流行病學(xué)調(diào)查、臨床診斷、病理剖檢變化、金標(biāo)卡檢測(cè)、免疫熒光抗體試驗(yàn)、兔體交互試驗(yàn)、回歸動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上診斷豬瘟，然后根據(jù)GenBank登錄的豬瘟病毒shimen和C株的E2基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物，采摘病死豬的血液、扁桃體、淋巴結(jié)、脾、腎等組織提取總RNA，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序后

3、進(jìn)行核苷酸序列比較分析。結(jié)果表明：該流行毒株是豬瘟病毒，與豬瘟病毒shimen和C毒株核苷酸的同源性分別為98.9％和94.9％。
　　在上述實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選用pMD18-T載體，通過(guò)對(duì)目的DNA的純化、連接和轉(zhuǎn)化，構(gòu)建了pMD18-T-E2重組質(zhì)粒，抽提重組質(zhì)粒pMD18-T-E2，經(jīng)雙酶切鑒定純化后，將E2基因分別連接到pcDNA3.1(-)和pET-32a(+)表達(dá)載體上并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽(yáng)性克隆，經(jīng)酶切和測(cè)序，成功構(gòu)建了

4、豬瘟病毒貴州毒株原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a-E2和真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-E2。
　　將構(gòu)建好的原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a-E2，轉(zhuǎn)化至宿主菌BL21中，誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白，表達(dá)產(chǎn)物做SDS-PAGE電泳、Western-blot分析，得到了約58kDa左右條帶，與預(yù)期大小相符，表明豬瘟E2基因在大腸桿菌中進(jìn)行了高效表達(dá)，并具有一定的生物學(xué)活性。進(jìn)一步提取、純化目的蛋白，將目的蛋白加入弗氏佐劑免疫小鼠，免疫后采血檢測(cè)抗體，結(jié)果顯示