結(jié)核分枝桿菌葉酸代謝相關(guān)基因Rv0992c的性質(zhì)及功能研究.pdf

1、結(jié)核病嚴(yán)重危害人類的生命健康，其致病菌結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)感染過全世界近三分之一的人口。隨著人們對結(jié)核分枝桿菌生物學(xué)特征及生理代謝的了解，相繼研發(fā)了鏈霉素、異煙肼、利福平等治療性藥物，但是這些藥物的不合理利用引起耐藥分枝桿菌的出現(xiàn)。結(jié)核病控制工作中急需新型藥物的出現(xiàn)，所以尋找新的結(jié)核藥物作用靶點(diǎn)及開發(fā)新型抗結(jié)核藥物已成為當(dāng)前的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。這就需要加深對結(jié)核分枝桿菌生理代謝的了解。葉酸代謝是細(xì)

2、菌不可或缺的生理過程，其代謝途徑中所涉及的某些酶的編碼基因在結(jié)核分枝桿菌中還不是很清楚。
　　 本研究通過生物信息學(xué)方法對M.tuberculosis H37Rv的未知功能基因Rv0992c的蛋白產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能的分析及預(yù)測，并對該基因進(jìn)行克隆、表達(dá)及蛋白產(chǎn)物酶學(xué)活性研究。從之前對深紅紅螺菌(Rhodospirillum rubrum)的研究得知Rru_A1084基因編碼5-甲?；?四氫葉酸環(huán)連接酶(5-formyltetra

3、hydrofolatecyclo-ligase，也稱為次甲基-四氫葉酸合成酶，MTHFS)。M.tuberculosis中Rv0992c基因是Rru_A1084的同源物(二者的氨基酸序列具有32.7％的相似性和21.8％的同源性)，所以推測前者編碼結(jié)核分枝桿菌的5-甲酰基-四氫葉酸環(huán)連接酶。從GenBank數(shù)據(jù)庫中獲得M.tuberculosis H37Rv的Rv0992c的核苷酸序列，設(shè)計(jì)一對引物，以M.tuberculosis H3

4、7Rv全基因組為模板，PCR擴(kuò)增獲得Rv0992c基因。通過TA克隆，將PCR產(chǎn)物連接到pMD19-T Simple Vector上，之后亞克隆至載體pET28上，經(jīng)菌落PCR，質(zhì)粒酶切以及核苷酸序列測序證明了成功的構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET28-Rv0992c。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Escherichia coli BL21(DE3)，以溫度、時間和IPTG濃度建立三因素三水平的正交實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化該重組蛋白質(zhì)誘導(dǎo)表達(dá)條件。以最佳表達(dá)條件(0.8mM的IP

5、TG，25℃下誘導(dǎo)4h)進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，Ni+凝膠親和層析柱純化獲得高純度的重組Rv0992c蛋白。純化蛋白的酶學(xué)活性通過反應(yīng)產(chǎn)物5，10-次甲基-四氫葉酸在355nm處吸光度的變化得到證實(shí)。
　　 運(yùn)用Vector NTI9，Swiss Model等生物信息學(xué)資源對結(jié)核分枝桿菌Rv0992c編碼蛋白的基本性質(zhì)進(jìn)行了分析，包括對蛋白質(zhì)等電點(diǎn)和分子量的預(yù)測，二級結(jié)構(gòu)以及三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測分析。結(jié)果表明：m.tuberculosis H3

6、7Rv Rv0992c基因編碼蛋白分子量為21412.95Da，理論P(yáng)I為9.40；二級結(jié)構(gòu)是由3個α螺旋8個β折疊及無規(guī)則卷曲構(gòu)成的。在一二級結(jié)構(gòu)分析的基礎(chǔ)上，利用同源建模的方法完成了其三維結(jié)構(gòu)的建模。分析該蛋白在分枝桿菌屬中的分布情況，結(jié)果顯示M.tuberculosisH37Rv的MTHFS同已報(bào)道的其他分枝桿菌屬來源的MTHFS有較高的同源性。綜上，本研究揭示了M.tuberculosis H37Rv Rv0992c序列編碼蛋白