結(jié)核分枝桿菌Rv2389c和Rv2450c基因的克隆表達(dá)及其生物學(xué)功能的初步研究.pdf

1、本課題克隆表達(dá)了結(jié)核分枝桿菌Rv2389c和Rv2450c基因，并初步研究了其生物學(xué)活性。主要研究工作如下： 一、結(jié)核分枝桿菌Rv2389c和Rv2450c基因的克隆表達(dá)及蛋白的純化。根據(jù)GenBank中結(jié)核分枝桿菌H37Rv基因組核酸序列(登錄號(hào)：NC000962)中Rv2389c和Rv2450c基因的cDNA序列，用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)含BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位點(diǎn)的特異性引物。以結(jié)核分枝桿菌H37Rv

2、基因組為模板，利用熱啟動(dòng)PCR方法分別擴(kuò)增出兩個(gè)目的基因片斷。將兩個(gè)片斷分別克隆入克隆載體pSP73，酶切鑒定正確后，再分別克隆入原核表達(dá)載體pGEX-4T-2，測(cè)序證實(shí)序列與GenBank中報(bào)告的完全一致后，用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE證實(shí)成功表達(dá)出了兩個(gè)融合蛋白。將誘導(dǎo)表達(dá)后的大腸桿菌超聲裂解后，分別取上清、沉淀和菌體做SDS-PAGE電泳，發(fā)現(xiàn)表達(dá)的蛋白以可溶性和包涵體兩種形式存在。隨后用GSTrapFF親和層析柱純化

3、可溶性蛋白，用凝血酶水解回收并測(cè)定得到蛋白的濃度，Rv2389c蛋白的濃度為306.9μg.ml-1，Rv2450c蛋白的濃度為349.8μg.ml-1，保存于-20℃?zhèn)溆谩?二、Rv2389c和Rv2450c蛋白生物學(xué)功能的初步研究。分別培養(yǎng)藤黃微球菌、BCG和結(jié)核分枝桿菌H37Rv，制成適當(dāng)濃度的菌懸液，然后分別加入四種不同濃度(1pM、10pM、100pM、1000pM)的兩種蛋白，置37℃，取不同時(shí)間點(diǎn)的菌懸液測(cè)定OD6

4、00值，并分別繪制生長(zhǎng)曲線。結(jié)果顯示，Rv2389c和Rv2450c蛋白對(duì)藤黃微球菌、BCG和結(jié)核分枝桿菌H37Rv都有促進(jìn)生長(zhǎng)的作用，經(jīng)上述重組蛋白作用后菌懸液的吸光度值OD600都高于對(duì)照組菌懸液約0.6～1.2；兩種蛋白對(duì)BCG和結(jié)核分枝桿菌H37Rv的促進(jìn)作用比對(duì)藤黃微球菌的作用顯著；在相同濃度下Rv2450c蛋白的促生長(zhǎng)作用總體強(qiáng)于Rv2389c蛋白。 綜上所述，本研究成功克隆了結(jié)核分枝桿菌Rv2389c和Rv2450