Cdk5通路在腦缺血再灌注損傷中的作用及神經(jīng)調(diào)節(jié)素1β抗凋亡機(jī)制研究.pdf

1、目的：在前期研究工作基礎(chǔ)上，研究大鼠腦缺血2h再灌注22h后，Cdk5信號通路的表達(dá)情況；探討NRG1β對Cdk5通路的影響、能否通過Cdk5通路抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，及其具體作用機(jī)制和關(guān)鍵環(huán)節(jié)，為將來應(yīng)用NRG1β防治缺血性腦血管病提供理論依據(jù)。
　　方法：⑴成年健康雄性Wistar大鼠360只，應(yīng)用線栓法經(jīng)左側(cè)頸外-頸內(nèi)動脈插線建立大腦中動脈缺血再灌注（MCAO/R）模型，隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為假手術(shù)（Sham）組55只、模型（M

2、CAO/R）組、治療（NRG1β）組、抑制劑+治療（Ros+NRG1β）組和抑制劑（Ros）組，每組動物55只。⑵Sham組線栓不入顱、不建立MCAO模型，2h后經(jīng)ECA殘端向ICA內(nèi)注射0.1mol/L PBS5μl；MCAO/R組建立MCAO/R模型后2h拔除線栓，同步經(jīng)ECA殘端向ICA內(nèi)注射0.1mol/L PBS5μl；NRG1β組動物缺血2h后拔除線栓，同時經(jīng)ECA殘端向ICA內(nèi)微量注射8%NRG1β5μl（2μg/kg）；

3、Ros+NRG1β組在插線前經(jīng)ECA殘端向 ICA注射 Roscovine5μl，缺血2h后拔除線栓實現(xiàn)再灌注，同時給予8%NRG1β5μl；Ros組注射Roscovine同Ros+NRG1β組，但缺血2h后拔除線栓時同步給予0.1mol/l PBS5μl。⑶治療后（或再灌注后）22h應(yīng)用改良神經(jīng)功能缺損評分（mNSS評分）測試動物神經(jīng)功能，干濕重法測量大鼠腦組織含水量，氯化三苯基四氮唑（TTC）染色測量腦梗死體積，HE染色和甲苯胺藍(lán)（

4、Nissl）染色觀察神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)，透射電鏡（TEM）觀察神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)，原位TUNEL法和流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)（FCM）檢測細(xì)胞凋亡，免疫組化（IHC）和Western Blot檢測Calpain1、p35/p25、Cdk5、p-Tau蛋白在神經(jīng)元內(nèi)的定位定量表達(dá)。
　　結(jié)果：①NRG1β對大鼠神經(jīng)行為功能的影響：Sham組無神經(jīng)行為功能缺損表現(xiàn)，mNSS評分0分；MCAO/R組、NRG1β組、Ros+NRG1β組、Ros組大鼠存在

5、不同程度神經(jīng)行為功能缺損的表現(xiàn)，mNSS評分較Sham組顯著升高（P＜0.05），NRG1β組、Ros+NRG1β組、Ros組大鼠神經(jīng)行為功能缺損較MCAO/R組均有改善，mNSS評分較MCAO/R組有不同程度下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；Ros+NRG1β組大鼠mNSS評分最低，與其他各組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。②NRG1β對大鼠腦組織含水量的影響：MCAO/R組、NRG1β組、Ros+NRG1β組、Ros

6、組大鼠腦組織含水量顯著高于Sham組（P＜0.05）；NRG1β組、Ros+NRG1β組、Ros組含水量較MCAO/R組均有下降（P＜0.05）；NRG1β組與Ros組比較腦組織含水量無明顯差異（P＞0.05）；Ros+NRG1β組較 MCAO/R組、NRG1β組、Ros組腦組織含水量顯著降低（P＜0.05）。③NRG1β對大鼠腦梗死體積的影響：Sham組未見腦梗死病灶；MCAO/R組、NRG1β組、Ros+NRG1β組、Ros組與Sh

7、am組相比，腦梗死體積不同程度地增大，差異顯著（P＜0.05）；MCAO/R組梗死體積較 NRG1β組、Ros組及 Ros+NRG1β組均明顯增大，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；NRG1β組與Ros+NRG1β組腦梗死體積較Ros組顯著減?。≒＜0.05），而Ros+NRG1β組腦梗死體積最小，與其他各組比較均有顯著性差異（P＜0.05）。④NRG1β對神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響：HE染色和Nissl染色均顯示：Sham組形態(tài)結(jié)構(gòu)正常、

8、未見明顯變性壞死的神經(jīng)元細(xì)胞，變性細(xì)胞指數(shù)（DCI）低；MCAO/R組、NRG1β組、Ros組、Ros+NRG1β組與Sham組相比，DCI明顯升高，出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)元細(xì)胞損傷情況，如細(xì)胞排列紊亂、固縮、胞膜破裂，胞核消失，空泡樣變等，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；NRG1β組、Ros組、Ros+NRG1β組DCI較MCAO/R組有不同程度地下降，其形態(tài)結(jié)構(gòu)、神經(jīng)元細(xì)胞損傷介于Sham組與MCAO/R組之間，差異有顯著性（P＜0.

9、05）；Ros+NRG1β組較NRG1β組、Ros組DCI均有下降，變性壞死的神經(jīng)元細(xì)胞更為減少，細(xì)胞損傷程度減輕，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。⑤NRG1β對神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)的影響：Sham組神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞核大而圓、染色質(zhì)分布均勻，細(xì)胞器豐富，細(xì)胞膜、核膜完整，神經(jīng)元軸突正常、微管正常，偶見凋亡的神經(jīng)細(xì)胞；MCAO/R組與Sham組相比，神經(jīng)元損傷嚴(yán)重，細(xì)胞固縮，細(xì)胞器數(shù)量明顯降低甚至消失、空泡變性，形成凋亡小體、神經(jīng)細(xì)胞

10、凋亡顯著；NRG1β組、Ros+NRG1β組、Ros組神經(jīng)元損傷介于Sham組和MCAO/R組之間；NRG1β組與Ros組神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)接近；Ros+NRG1β組損傷更輕、神經(jīng)細(xì)胞凋亡較 NRG1β組及 Ros組亦有改善，部分出現(xiàn)空泡，細(xì)胞結(jié)構(gòu)較正常完整、邊緣清楚，細(xì)胞器損傷亦減輕，細(xì)胞連接較緊密。⑥NRG1β對細(xì)胞凋亡的影響：TUNEL法顯示：Sham組頂葉皮層神經(jīng)元細(xì)胞淺染為淡藍(lán)色，絕大部分細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整、排列整齊，胞膜光滑，胞漿豐富

11、，細(xì)胞核清晰可見，細(xì)胞間質(zhì)無水腫等；偶見細(xì)胞凋亡；MCAO/R組可見大量神經(jīng)細(xì)胞凋亡，細(xì)胞排列紊亂、固縮、胞膜皺縮、細(xì)胞質(zhì)被染成棕色，胞核被染成褐色或棕褐色，或固縮、碎裂，甚至崩解、形成空泡；NRG1β組、Ros+NRG1β組、Ros組神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)改善、排列較為整齊，結(jié)構(gòu)相對完整，部分神經(jīng)細(xì)胞核固縮、碎裂、形成空泡；Ros+NRG1β組，較NRG1β組、Ros組明顯改善，變性壞死神經(jīng)元減少；FCM法與TUNEL法均顯示：MCAO/R組

12、、NRG1β組、Ros+NRG1β組、Ros組與 Sham組相比，早期凋亡細(xì)胞指數(shù)（EACI）、凋亡細(xì)胞指數(shù)（ACI）均顯著升高（P＜0.05）。Ros+NRG1β組、NRG1β組、Ros組與MCAO/R組相比，EACI、ACI不同水平下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。Ros+NRG1β組與NRG1β組、Ros組比較，EACI、ACI均有下降，差異有顯著性（P＜0.05）。⑦NRG1β對蛋白定位表達(dá)的影響：IHC染色顯示：Calp

13、ain1：MCAO/R組較Sham組，陽性細(xì)胞數(shù)指數(shù)（PCI）顯著升高（P＜0.05）；NRG1β組、Ros+NRG1β組，PCI較MCAO/R組明顯降低（P＜0.05），而兩兩比較無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；Ros組 Calpain1表達(dá)較 MCAO/R組無顯著性差異（P＞0.05），與 NRG1β組、Ros+NRG1β組差異明顯（P＜0.05）;Cdk5：與Sham組比較，MCAO/R組、NRG1β組、Ros+NRG1β組、Ros

14、組PCI明顯升高，差異有顯著性（P＜0.05）；而MCAO/R組、NRG1β組、Ros+NRG1β組、Ros組PCI之間兩兩比較，差異無顯著性（P＞0.05）;p35/p25：MCAO/R組、Ros組p35/p25表達(dá)較Sham組明顯增強(qiáng)，PCI顯著升高，（P＜0.05），但兩兩比較無顯著差異（P＞0.05）；NRG1β組、Ros+NRG1β組p35/p25表達(dá)較MCAO/R組、Ros組明顯減少（P＜0.05），而NRG1β組與Ros+

15、NRG1β組比較無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）;p-Tau：MCAO/R組、NRG1β組、Ros+NRG1β組、Ros組，與Sham組比較，蛋白表達(dá)明顯增加，PCI顯著升高（P＜0.05）；NRG1β組、Ros組、Ros+NRG1β組，PCI較MCAO/R組不同程度下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；Ros+NRG1β組，與NRG1β組和Ros組比較PCI降低，差異顯著（P＜0.05）；與Ros組比較，NRG1β組p-Tau表達(dá)較低，

16、PCI下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。⑧NRG1β對蛋白定量表達(dá)的影響：Western blot顯示：Calpain1：MCAO/R組較Sham組，Calpain1相對蛋白含量明顯增加（P＜0.05）；NRG1β組、Ros+NRG1β組，相對蛋白含量較 MCAO/R組明顯降低（P＜0.05），而其兩兩比較無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；Ros組Calpain1表達(dá)較MCAO/R組無顯著性差異（P＞0.05），與NRG1β組、Ros

17、+NRG1β組比較則均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；Cdk5：與Sham組比較，MCAO/R組、NRG1β組、Ros+NRG1β組、Ros組Cdk5相對蛋白含量明顯升高（P＜0.05）；而MCAO/R組、NRG1β組、Ros+NRG1β組、Ros組間兩兩比較，差異無顯著性（P＞0.05）；p35/p25：MCAO/R組、Ros組較Sham組p35/p25蛋白表達(dá)明顯增加，相對蛋白含量均顯著升高（P＜0.05），但MCAO/R組與Ros組

18、蛋白表達(dá)無差異（P＞0.05）；NRG1β組、Ros+NRG1β組蛋白表達(dá)較MCAO/R組、Ros組明顯減少（P＜0.05），而NRG1β組與Ros+NRG1β組蛋白相對含量比較無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；p-Tau：MCAO/R組、NRG1β組、Ros+NRG1β組、Ros組，與Sham組比較p-Tau蛋白表達(dá)明顯增加、相對蛋白含量顯著升高（P＜0.05）；NRG1β組、Ros組、Ros+NRG1β組，p-Tau表達(dá)較MCAO/R組

19、不同程度下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；Ros+NRG1β組p-Tau相對蛋白含量最低，與NRG1β組和Ros組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與Ros組比較，NRG1β組p-Tau蛋白表達(dá)較低，相對蛋白含量少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　結(jié)論：腦缺血再灌注損傷發(fā)生后，Cdk5通路過度激活，導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞凋亡；其特異性抑制劑Roscovitine可以阻斷Cdk5通路誘導(dǎo)凋亡的作用，有利于腦缺血再灌注損