CKIP-1在炎癥介導(dǎo)下對(duì)增齡性骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨作用研究.pdf

1、研究目的：
　　骨質(zhì)疏松癥是一種沉默性骨代謝疾病，表現(xiàn)為骨量的降低和骨結(jié)構(gòu)的惡化，它可以顯著提高個(gè)體的骨折風(fēng)險(xiǎn)并給患者帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，尤其對(duì)于65歲以上的老年人，嚴(yán)重的骨質(zhì)疏松會(huì)導(dǎo)致骨折給患者帶來(lái)殘疾的風(fēng)險(xiǎn)。骨重建中成骨前體細(xì)胞的主要來(lái)源是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs），對(duì)其進(jìn)行調(diào)控可以影響成骨及成脂的分化。CKIP-1是酪蛋白激酶相互作用蛋白1，它是成骨的負(fù)調(diào)控因子，敲除CKIP-

2、1可導(dǎo)致Smurf1活性下降，MEKK2蛋白水平、磷酸化JNK及磷酸化c-Jun水平均上調(diào)，從而使JNK-AP-1通路活性上調(diào)，使成骨能力升高。然而CKIP-1在MSCs調(diào)控骨分化方面的作用仍不清楚。本實(shí)驗(yàn)以CKIP-1基因敲除小鼠的骨量增加為入手點(diǎn)，首先探討增齡性小鼠的繁育性能及生長(zhǎng)發(fā)育差異；其次，觀察了在體外培養(yǎng)的小鼠MSCs中CKIP-1基因缺失對(duì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性影響，比較了小鼠體內(nèi)及體外成骨差異；最后，初步研究了炎癥微環(huán)境條件

3、下增齡性變化對(duì)CKIP-1的表達(dá)及體外成骨能力的影響，從而為骨質(zhì)疏松癥的防治提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　研究方法：
　　1.建立CKIP-1基因敲除小鼠繁育體系，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chainreaction，PCR）技術(shù)對(duì)擴(kuò)群子代小鼠基因型進(jìn)行鑒定。測(cè)定CKIP-1基因敲除小鼠與 C57BL/6J野生型小鼠在繁育性能及體重，尾長(zhǎng)的變化，分析基因敲除小鼠的生長(zhǎng)發(fā)育情況。
　　2.采用全骨髓培養(yǎng)法分離

4、培養(yǎng)WT（CKIP-1+/+）和KO（CKIP-1-/-）小鼠的MSCs，行MTT實(shí)驗(yàn)及克隆實(shí)驗(yàn)比較兩組小鼠MSCs的增殖能力，成骨實(shí)驗(yàn)(茜素紅染色，ALP染色，實(shí)時(shí)定量PCR)、成脂實(shí)驗(yàn)（油紅O染色）檢測(cè)兩組細(xì)胞的多向分化能力，流式細(xì)胞術(shù)鑒定MSCs表面標(biāo)記分子。
　　3.采用Micro-CT機(jī)掃描并重建2月齡和18月齡的WT和KO小鼠股骨的骨小梁形態(tài)，觀察骨質(zhì)影像學(xué)相關(guān)參數(shù)的差異，并分析骨含量的異同。
　　4.采用實(shí)時(shí)定

5、量PCR技術(shù)、Western blot方法分別對(duì)2月齡和18月齡的C57BL/6J野生型小鼠進(jìn)行體內(nèi)和體外的CKIP-1表達(dá)，以研究CKIP-1在體內(nèi)與體外的表達(dá)異同。
　　5.分別對(duì)2月齡和18月齡的C57BL/6J野生型小鼠注射IL-1β，采用實(shí)時(shí)定量PCR、Western blot檢測(cè)CKIP-1的表達(dá)差異，采用Micro-CT檢測(cè)兩組小鼠骨含量差異，初步探討CKIP-1與炎癥之間的關(guān)系。
　　結(jié)果：
　　1.成

6、功建立CKIP-1基因缺失小鼠的繁育體系，采用PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)進(jìn)行基因鑒定，KO小鼠不表達(dá)CKIP-1結(jié)構(gòu)中的3號(hào)外顯子，選取同窩同性別的WT及KO小鼠用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。兩組小鼠出生至第18個(gè)月，繁育性能和鼠尾長(zhǎng)度并沒(méi)有明顯差異。體重方面：從出生到第18個(gè)月，KO小鼠與WT小鼠體重在2月齡時(shí)無(wú)明顯差異（P＞0.05），隨著年齡的增長(zhǎng)，在第12月時(shí)WT小鼠的平均體重約為33g，而KO組小鼠的平均體重約為39g（P＜0.05），到第18月時(shí)KO組

7、小鼠的體重與WT組相差11g（P＜0.05）。
　　2.利用小鼠股骨分離培養(yǎng)WT和KO小鼠的MSCs，KO小鼠的MSCs形態(tài)類似成纖維細(xì)胞樣，以長(zhǎng)梭形為主，可形成均勻集落，流式細(xì)胞儀鑒定其高表達(dá)間充質(zhì)來(lái)源細(xì)胞表面標(biāo)記CD90、CD44、CD106。使用KO及WT小鼠第三代（P3）細(xì)胞行體外成骨誘導(dǎo)，7天后行ALP染色，胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞顆粒增多，21天后行茜素紅染色，出現(xiàn)紅色陽(yáng)性的礦化結(jié)節(jié)，胞質(zhì)內(nèi)充滿顆粒，細(xì)胞呈集落樣生長(zhǎng)，細(xì)胞間有大量的

8、礦化基質(zhì)形成。成骨誘導(dǎo)后，KO小鼠MSCs成骨能力強(qiáng)于WT（P＜0.05）。成骨誘導(dǎo)3天后，提取細(xì)胞總RNA，使用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)成骨、成脂相關(guān)基因的表達(dá)，KO組OCN、Runx2、PPAR-γ的表達(dá)較WT組均增多（P＜0.05）。成脂誘導(dǎo)21天后顯微鏡下觀察可見(jiàn)細(xì)胞立體感增強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)小脂滴，細(xì)胞由長(zhǎng)梭形變?yōu)閳A形或多邊形排列，進(jìn)行油紅O染色顯示有大量脂質(zhì)沉淀，油紅O染色定量結(jié)果顯示，行成脂誘導(dǎo)后，KO組成脂能力強(qiáng)于WT組（P＜0.

9、05），且KO小鼠MSCs脂滴多于WT小鼠。
　　3.分別對(duì)2月齡和18月齡的WT及KO小鼠的股骨行Micro-CT掃描，結(jié)果顯示在2月齡小鼠中，WT組小鼠的骨體積分?jǐn)?shù)（BV/TV）、特定骨表面積（BSA/BV）、骨小梁數(shù)目（TB.N）、骨小梁間隙（TB.Sp）與KO組小鼠無(wú)明顯差異（P＞0.05）,而在18月齡小鼠中，KO小鼠的骨體積分?jǐn)?shù)（BV/TV）、骨小梁數(shù)目（TB.N）較 WT小鼠增高（P＜0.05)，特定骨表面積（BSA

10、/BV）、骨小梁間隙（TB.Sp）較WT小鼠降低（P＜0.05）。
　　4.實(shí)時(shí)定量PCR及Western blot結(jié)果顯示在體外培養(yǎng)的2月齡和18月齡野生型小鼠MSCs中CKIP-1的表達(dá)無(wú)顯著性差異（P＞0.05），行成骨誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)后，CKIP-1在兩組中的表達(dá)亦無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。但實(shí)時(shí)定量PCR顯示，CKIP-1在體內(nèi)獲得的骨髓中的表達(dá)為18月齡的小鼠比2月齡小鼠高約4.3倍（P＜0.05），Western blo

11、t顯示18月齡小鼠CKIP-1表達(dá)高于2月齡小鼠（P＜0.05）。
　　5.從2月齡和18月齡野生型小鼠股骨中提取MSCs，在體外加入IL-1β后培養(yǎng)，實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示，無(wú)論在2月齡還是18月齡小鼠組中，加入IL-1β均可增強(qiáng)CKIP-1的表達(dá)（P＜0.05）；同時(shí)，Western blot結(jié)果亦顯示加入IL-1β后，可增加CKIP-1的表達(dá)（P＜0.05）。為進(jìn)一步觀察炎癥在小鼠體內(nèi)是否影響CKIP-1的表達(dá)，我們對(duì)2月齡

12、小鼠進(jìn)行IL-1β腹腔注射，一周2次，對(duì)照組注射同等劑量PBS，3個(gè)月后取兩組小鼠的骨髓對(duì)CKIP-1表達(dá)進(jìn)行分析，實(shí)時(shí)定量 PCR結(jié)果顯示：IL-1β注射組的CKIP-1表達(dá)比對(duì)照組高3.2倍（P＜0.05），Westernblot結(jié)果顯示IL-1β注射組的CKIP-1表達(dá)比對(duì)照組高（P＜0.05）。Micro-CT結(jié)果顯示：IL-1β注射組小鼠的骨體積分?jǐn)?shù)及骨密度較對(duì)照組為低（P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　CKIP-