微重力條件下CKIP-1基因?qū)π∈蠊撬栝g充質(zhì)干細(xì)胞增殖及向成骨分化影響研究.pdf

1、目的：隨著我國(guó)太空事業(yè)的發(fā)展，宇航員太空活動(dòng)增多，駐留時(shí)間延長(zhǎng)，因失重導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松現(xiàn)象加重。同時(shí)隨著我國(guó)社會(huì)老齡化的加劇，骨質(zhì)疏松患者逐漸增多，給患者帶來(lái)嚴(yán)重的健康問(wèn)題和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。CKIP-1(酪氨酸激酶相關(guān)蛋白酶1)基因是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的骨分化、形成的負(fù)調(diào)控因子，能夠有效對(duì)抗失重性及廢用性骨質(zhì)疏松。本文主要探索微重力環(huán)境下，CKIP-1基因?qū)π∈驜MSCs細(xì)胞增殖、凋亡及成骨分化的影響及分子機(jī)制探討研究，為治療骨質(zhì)疏松找到新的方法。<

2、br>　　方法：
　　1、敲除CKIP-1基因的BMSCs（knockout，KO-BMSCs）及正常BMSCs細(xì)胞提?。篊KIP-1基因小鼠和野生型小鼠雜交繁育后，PCR法鑒定4周齡敲除CKIP-1基因小鼠（Knockout,KO型）與野生型C57BL/6小鼠(wildtype，WT型)，股骨離斷用全骨髓法提取兩組BMSCs細(xì)胞，傳代培養(yǎng)，分離，純化。觀察細(xì)形態(tài)，胞流式細(xì)胞學(xué)鑒定純度。并用細(xì)胞計(jì)數(shù)法及MTT法檢測(cè)正常重力下CKI

3、P-1對(duì)細(xì)胞增殖影響。
　　2、將BMSCs細(xì)胞（KO-BMSCs及WT-BMSCs）分別在不同重力環(huán)境中培養(yǎng)。細(xì)胞分為4組分為：①野生型BMSCs細(xì)胞正常重力組（wildtype–normalgravity，WT-NG）；②敲除CKIP-1型BMSCs細(xì)胞正常重力組(knockout–normalgravity,KO-NG);③敲除CKIP-1型BMSCs細(xì)胞微重力組（knockout–microgravity，KO-MG）④野

4、生型BMSCs細(xì)胞微重力組（wildtype–microgravity,WT-MG）。微重力環(huán)境用體外細(xì)胞旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)系統(tǒng)（RCCS）模擬，均在體外行成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)5天后行相關(guān)檢測(cè)。
　　3、細(xì)胞增殖及成骨分化相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)
　　3.1MTT測(cè)量細(xì)胞0、3、5天細(xì)胞的增殖
　　3.2流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)及RT-PCR測(cè)定Bcl-2基因表達(dá)分析各組細(xì)胞的凋亡
　　3.3茜素紅染色檢測(cè)各組細(xì)胞的礦化程度
　　3.4細(xì)胞微絲染

5、色
　　3.5細(xì)胞堿性磷酸酶（ALP）濃度測(cè)定及染色
　　3.6RT-PCR檢測(cè)成骨相關(guān)基因的表達(dá)
　　3.7Westernblot檢測(cè)成骨相關(guān)蛋白的表達(dá)
　　結(jié)果：
　　1、敲除CKIP-1基因后，小鼠的生命體征及生長(zhǎng)發(fā)育未受明顯影響。KO-BMSCs細(xì)胞和WT-BMSCs在體外可以正常增殖生長(zhǎng)。通過(guò)傳代培養(yǎng)4代后BMSCs純度可達(dá)90％以上。細(xì)胞計(jì)數(shù)顯示KO-BMSCs增殖率低于WT-BMSCs組，MT

6、T試驗(yàn)結(jié)果顯示二者之間未有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；
　　2.微重力條件抑制細(xì)胞增殖及BMSCs向成骨細(xì)胞的分化；微重力環(huán)境促進(jìn)細(xì)胞凋亡，敲除CKIP-1基因促進(jìn)了細(xì)胞的凋亡；
　　3.微重力環(huán)境中BMSCs細(xì)胞由梭形變?yōu)閳A形，WT-BMSCs形態(tài)變化較KO-BMSCs組弱。同時(shí)在微重力條件下兩組BMSCs細(xì)胞的微絲變細(xì)，排列紊亂，但敲除CKIP-1基因能有效對(duì)抗微絲變化，保持微絲形態(tài)；
　　4.敲除CKIP-1基因后BMSCs

7、細(xì)胞成骨分化能力增強(qiáng)，BMP/Smad信號(hào)通道表達(dá)增強(qiáng)，成骨相關(guān)基因及蛋白的表達(dá)增強(qiáng)，而微重力環(huán)境中該趨勢(shì)受到抑制。
　　結(jié)論：
　　1、敲除CKIP-1后小鼠的生命體征及生長(zhǎng)發(fā)育未受明顯影響，敲除CKIP-1基因后小鼠BMSCs增殖率降低；
　　2、敲除CKIP-1后BMSCs細(xì)胞增值率降低，但敲除CKIP-1基因能有效對(duì)抗微重力阻礙BMSCs向成骨細(xì)胞分化的效應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞的成骨分化，可以為治療骨質(zhì)疏松治療提供新的思