ILK與RI的相互作用通過(guò)ILK信號(hào)通路調(diào)節(jié)膀胱癌EJ細(xì)胞EMT的分子機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　研究整合素連接激酶（ILK）與核糖核酸酶抑制因子（RI）蛋白的相互作用，探討兩者相互作用對(duì)膀胱癌EJ細(xì)胞的ILK信號(hào)通路及EMT影響的分子機(jī)制。
　　方法：
　　1.根據(jù)ILK基因序列設(shè)計(jì)引物，經(jīng)PCR法擴(kuò)增獲得ILK基因片段后，分別連接到真核表達(dá)載體 pEYFP-N1和 pCMV-3xflag-CMVTM-10上。通過(guò)酶切和DNA測(cè)序鑒定載體，并分別命名為pEYFP-N1-ILK and pCMV-3×F

2、lag-ILK。將pCMV-3×Flag-ILK載體和對(duì)照空白載體，以及LV5-RNH1和 LV5NC分別穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 EJ細(xì)胞株，命名為 EJ-ILK， EJ-FLAG，EJ-RI和 EJ-LV5，經(jīng) Western blot和細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)蛋白過(guò)表達(dá)情況。
　　2.在EJ和HEK293細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行ILK與RI的免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，熒光共振能量轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)和免疫熒光共定位實(shí)驗(yàn)，用以研究體內(nèi)的相互作用。在細(xì)胞外應(yīng)用GST pulldown實(shí)驗(yàn)

3、研究ILK與RI在體外的相互作用。
　　3.CCK8檢測(cè)各組細(xì)胞增殖能力；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期；細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)蛋白R(shí)I,ILK,p-Akt和p-GSK3β表達(dá)水平；小管形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ILK和RI相互作用對(duì)體外血管生成的影響。
　　3.收集的穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株EJ-ILK，EJ-FLAG，EJ-RI，EJ-LV5和EJ,用Western blot檢測(cè)ILK與RI相互作用對(duì)EJ細(xì)胞EMT及ILK信號(hào)通路的影響。
　　5.構(gòu)建

4、BALB/C裸鼠移植瘤模型，觀察移植瘤生長(zhǎng)，腫瘤微血管生長(zhǎng)以及肺轉(zhuǎn)移情況；應(yīng)用免疫組化和組織免疫熒光檢測(cè)腫瘤組織中EMT相關(guān)蛋白及ILK信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)水平。另外，在臨床人膀胱癌及癌旁組織標(biāo)本中同時(shí)檢測(cè)了ILK及RI蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.測(cè)序結(jié)果顯示：重組真核表達(dá)質(zhì)粒 pEYFP-N1-ILK和pCMV-3×flag-ILK構(gòu)建正確。細(xì)胞免疫熒光和Western blot結(jié)果顯示ILK和RI在EJ細(xì)胞中成功

5、過(guò)表達(dá)。
　　2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示： ILK與RI在體內(nèi)和體外均存在相互作用。
　　4.CCK8結(jié)果顯示EJ-ILK細(xì)胞增值能力較對(duì)照組明顯增強(qiáng)，而EJ-RI細(xì)胞則明顯減弱；流式細(xì)胞分析結(jié)果表明EJ-RI細(xì)胞與對(duì)照組相比，明顯阻滯于S期；小管形成實(shí)驗(yàn)提示RI和EJ相互作用能夠抑制體外血管的形成。
　　3.通過(guò)檢測(cè)各組穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，顯示EMT相關(guān)蛋白和ILK信號(hào)通路的一些關(guān)鍵靶蛋白呈現(xiàn)顯著的變化。
　　5.BALB/

6、C裸鼠注射各組細(xì)胞后，與2個(gè)對(duì)照組相比，EJ-ILK組瘤重明顯增加；而EJ-RI組與對(duì)照組比較，瘤重明顯降低。組織免疫熒光和HE染色結(jié)果提示EJ-ILK組微血管明顯增加，EJ-RI組則明顯減少。肺組織HE染色實(shí)驗(yàn)表明，EJ-ILK組有明顯肺轉(zhuǎn)移，而EJ-RI組未見(jiàn)明顯轉(zhuǎn)移。免疫組織化學(xué)和免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示：EJ-ILK組中EMT及ILK信號(hào)通路蛋白變化明顯；EJ-RI組中EMT相關(guān)蛋白和ILK通路關(guān)鍵蛋白與對(duì)照組比較有顯著變化，且與E