粘附斑激酶通過Tuberin調(diào)節(jié)mTOR信號通路活性的分子機制.pdf

1、mTOR(mammaliantargetofrapamycin)屬于PIKK(phosphatidylinositolkinase-relatedkinase)超家族，是一個進化上十分保守的Ser/Thr激酶。它可以整合上游來自生長因子、營養(yǎng)、能量及環(huán)境壓力的信號刺激，作用于其下游效應分子，進而在細胞增殖、生長等方面起著重要的調(diào)控作用。
　　 粘附斑激酶(Focaladhesionkinase，F(xiàn)AK)是一種胞質(zhì)非受體蛋白酪氨酸

2、激酶，可以整合來自胞外的營養(yǎng)、壓力、細胞粘著等信號來調(diào)控細胞的生長、遷移等，是胞內(nèi)外信號轉導的中樞。
　　 復合型結節(jié)性硬化癥(TuberousSclerosisComplex，TSC)是一種由常染色體突變導致的顯性遺傳疾病，由TSC1或TSC2兩個基因突變所引起。Tuberin是TSC2基因產(chǎn)物，與TSC1基因產(chǎn)物Hamartin在細胞內(nèi)以異源二聚體的形式發(fā)揮作用，是mTOR的上游負調(diào)控因子。
　　 FAK、Tuber

3、in都是參與mTOR信號通路調(diào)節(jié)的重要蛋白。但FAK是否可以通過與Tuberin的直接相互作用而參與mTOR信號通路調(diào)控尚不清楚。
　　 本研究以人293T細胞、小鼠STO細胞和絨山羊胎兒成纖維細胞為材料，首先利用RNA干擾技術探究FAK表達受抑制后，其下游的效應分子Akt、mTOR、S6K、S6的活性變化情況，明確FAK參與了mTOR信號通路的調(diào)控；次之以FAK作為誘餌蛋白利用免疫共沉淀和Westernblot技術檢測沉淀復合

4、物中Tuberin的存在，證明其有可能為FAK的作用靶。最后利用酵母雙雜交技術鑒定FAK與Tuberin作用的具體片段。
　　 結果表明：1)FAK轉錄后沉默，mTOR信號通路的活性受到抑制。通路中phospho-mTOR(Ser2448)、phosphor-p70S6K(Thr389)、phospho-S6(Ser240/244)的活性明顯降低，但phospho-Akt(Ser473)的活性無顯著變化；2)FAK免疫共沉淀復合

5、物中有Tuberin存在，但不能檢出Akt；3)酵母雙雜交實驗表明全長FAK(aa.1-1052)和含有FAT結構域的C-末端片段FAK3(665-1052aa)與Tuberin的中間片段TSC2F(aa.419-1080)具有直接的相互作用，可以激活全部四種報告基因AUR1-C、MEL1、HIS3與ADE2的表達。FAK的N-末端FERM結構域FAK1(aa.1-400)和中間的激酶結構域FAK2(aa.401-664)與TSC2F之

6、間沒有或僅有較弱的相互作用，沒有激活報告基因HIS3與ADE2。FAK的C-末端片段(665-1052aa)為FAK與Tuberin發(fā)生作用所必需。
　　 綜合RNAi、免疫共沉淀和酵母雙雜交的實驗結果并通過不同物種細胞系間結果的相互印證，可以確定FAK與Tuberin之間存在直接的相互作用關系，這種作用主要依賴于FAKC-末端片段的介導，F(xiàn)AK通過Tuberin直接參與mTOR信號通路的調(diào)控。這一研究結果使FAK信號通路和TS